单抗药物中分子质量、氨基酸序列以及糖基化位点检测方案(液质联用仪)

聂爱英 LTQ-Orbitrap Elite；单抗药物；分子质量分析；氨基酸序列分析；糖基化位点分析 1.前言 单抗药物主要是由两条重链和两条轻链通过链内和链间二硫键以及非共价键组成，分子质量大约在150kD 左右，每条重链和轻链在N端都包含一个可变区域，在C端都包含一个恒定区域，并且在每条重链上还存在一个 N 糖基化位点，该位点含有不同的糖链结构，如图1所示。目前，在生物制药领域中，单抗药物以其高效的治疗靶向性和特异性，越来越受到制药公司和医疗单位的青睐。为了保证单抗药物的有效性，以及单抗药物生产过程的实时监控，对于单抗药物的整体分子质量的测定、氨基酸序列的鉴定，糖基化位点的确认，二硫键的定位，糖链结构的解析等重要的分析技术，越来越受到制药公司的关注。随着生物质谱技术的不断发展和推广，基于生物质谱的单抗分析技术也开始全面、快速的开展起来。 目前， LTQ-Orbitrap Elite 组合式质谱仪结合了以前的双压线性离子阱质谱仪和新型高场 OrbitrapTM 质量分析器，提高了 MS和 MSn 的性能和多功能性。该系统具有高于240，000 的分辨率(FWHM)、更高的灵敏度、高扫描速度和更大的动态范围，同时结合了多种碎裂技术，为深度复杂样品分析，包括蛋白质组学、代谢组学、脂类组学等样品的鉴定，翻译后修饰和定量分析，提供了全面、高效和快速的质谱分析平台。 图1.单抗药物的简单结构示意图(Ⅴ表示可变区域，C表示恒定区域，L表示轻链，H表示重链。 2.1分子质量测定 2.1.1仪器和试剂 质谱仪器： LTQ-Orbitrap Elite (赛默飞世尔科技，美国)； 色谱仪器：Accela 液相色谱系统(赛默飞世尔科技，美国)； 色谱柱： BioBasic 色谱柱(C8，1×100 mm， 5pm， 300A)(赛默飞世尔科技，美国)； 试剂：1：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸。 2.1.2仪器方法 色谱分析条件：具体见表1； 质谱分析条件：具体见表2； 2.1.3数据分析方法 采用 Protein Deconvolution 2.0软件对原始质谱图进行去卷积处理，得到完整的蛋白质分子质量信息。 表1.单抗分子质量测定的色谱分析条件 流动相 A：0.1%甲酸水溶液；B：0.1%甲酸乙腈溶液 流速 300 uL/min 柱温 75℃ 色谱梯度 时间/min B相浓度/% 0 0 0.5 8 1.5 30 11.5 50 12 90 14 90 14.5 0 16 0 表2.单抗分子质量测定的质谱分析条件 喷雾电压 4kV 毛细管加热温度 275℃ S-lens 60% 鞘气流速 25(arb) 辅助气流速 10(arb) 质量扫描范围 m/z 2000-4000 分辨率 15000(m/z 400) 2.2.1仪器和试剂 质谱仪器： LTQ-Orbitrap Elite (赛默飞世尔科技，美国)； 色谱仪器： Easy-nLC 1000液相色谱系统(赛默飞世尔科技，美国)； 色谱柱： Nano 色谱柱(C18，75pmx150 mm， 22um，100A)(赛默飞世尔科技，美国)； 试剂：：-二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸， PNGaseF内切糖苷酶，，二硫苏糖醇(DTT)，碘乙酰胺(IAA)， trypsin 内切蛋白酶。 2.2.2仪器方法 色谱分析条件：具体见表3； 质谱分析条件：具体见表4； 2.2.3数据分析方法 采用 Proteome Discoverer 1.3软件对原始谱图进行数据库搜索，具体搜库参数为：包含单抗氨基酸序列的数据库；半胱氨酸(C)烷基化(+57.021Da)设置为固定修饰；甲硫氨酸(M)氧化(+15.995Da)和天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)脱氨基化(+0.984Da)设置为可变修饰； trypsin 设置为酶；酶漏切位点为2。设置肽段的置信水平为99%，得到高置信的鉴定肽段和蛋白结果。 2.2.4样品前处理方法 将单抗样品首先进行 PNGaseF 酶解，切除糖链后的蛋白质，再进行 DTT 还原和 IAA烷基化，最后进行 trypsin 过夜酶解。 表3.氨基酸序列测定的色谱分析条件 流动相 A：0.1%甲酸水溶液；B：0.1%甲酸乙腈溶液 流速 350 nL/min 柱温 35℃ 色谱梯度 时间/min B相浓度/% 0 3 5 8 55 20 70 40 78 90 90 90 喷雾电压 2.3 kV 毛细管加热温度 275℃ S-lens 50% 碰撞能量 27%归一化能量 碎裂方式 HCD 质量扫描范围 m/z 300-1800 分辨率 一级30，000 ( m/z 400)， 二级15，000(m/z 400) 2.3糖基化位点测定 2.3.1仪器和试剂 质谱仪器： LTQ-Orbitrap Elite ( 赛默飞世尔科技，美国)； 色谱仪器： Easy-nLC 1000 液相色谱系统(赛默飞世尔科技，美国)； 色谱柱： Nano 色谱柱(C18，75um× 150mm，2um，100A)(赛默飞世尔科技，美国)； 试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸，二硫苏糖醇(DTT)，碘乙酰胺(IAA)， trypsin 内切蛋白酶。 2.3.2仪器方法 采用 Byonic 1.1 软件对原始谱图进行数据库搜索，具体搜库参数为：包含单抗氨基酸序列和N糖基化结构的数据库；半胱氨酸(C)烷基化(+57.021Da)设置为固定修饰；甲硫氨酸(M)氧化(+15.995Da)和天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)脱氨基化(+0.984Da)设置为可变修饰； trypsin设置为酶；酶漏切位点为2。最终通过人工确认，得到准确的糖基化修饰肽段的鉴定信息。 3.1蛋白质分子质量测定 基于高分辨质谱iLLTQ-Orbitrap Elite， 为了保证采集谱图的质量和数量，我们设定高场 Orbitrap 检测器的采集分辨率为15，000。 经过LTQ-Orbitrap Elite 质谱采集的单抗原始质谱谱图如图2-A所示，我们可以观察到不同的电荷分布的质谱图，选取强度最高的 m/z 为 2744.0384 的一组质谱峰为例，放大之后的质谱峰如图2-B所示，可以看到质谱图的灵敏度和信噪比都很高。 经过 Protein Deconvolution 2.0软件去卷积处理之后的单抗分子质量分布图(图3)，根据单抗的氨基酸序列理论分子质量进行计算，将观察到的质谱峰进行归属，可以初步推断该单抗药物存在多种形式的糖链结构，主要包括 G0、GOF、G1F和 G2F，该结论与常见的单抗组成基本一致，同时根据质谱峰的峰强度信息，我们还可以计算得到不同糖型单抗的相对定量信息，如图3中蓝色数字所示。 GO，GOF100 35.3%G0，G1F/G1，GOF96 33.9% 图3.LTQ-Orbitrap Elite 质谱采集的单抗原始质谱图经过 Protein Deconvolution 2.0 软件去卷积处理之后的单抗分子质量分布图(G0、GOF、G1F 和 G2F 表示不同类型的糖型，蓝色数字表示质谱峰所对应的峰强度和相对定量信息。) 3.2氨基酸序列测定 经过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱数据采集和 Proteome Discoverer 1.3软件的数据库搜索，以及肽段99%高置信水平卡值， 在 trypsin酶解实验中，单抗重链的蛋白序列覆盖度为97%，如图4-A所示，轻链的蛋白序列覆盖度为98%，如图 4-B所示，由此证明LTQ-Orbitrap Elite 质谱可以准确、有效地实现单抗氨基酸序列的成功鉴定。其中未鉴定到的氨基酸序列主要是由于酶切后肽段过短不适合质谱鉴定所造成的，为了实现100%的氨基酸序列覆盖，可以通过选择其它内切蛋白酶来实现。 单抗蛋白中一般都包含 N-糖基化修饰，也就是说肽链的天冬酰胺(Asn，N)残基可以与糖链的还原端连接，形成不同糖链结构的糖基化蛋白，一般发生N-糖基化修饰的位点都是在保守序列 NXS 或 NXT 中(×为除脯氨酸外的任意氨基酸)。在经过内切糖苷酶 PNGaseF酶切后，天冬酰胺(Asn，N)残基会丢失糖链，产生 0.984 Da 的质量增加。不过在样品处理过程中也可能会导致天冬酰胺、谷氨酰胺发生脱氨基化，同样会使天冬酰胺产生 0.984 Da 的质量增加。最终的搜库结果显示一些天冬酰胺残基存在0.984 Da 的质量增加，这可能是由于样品发生了脱氨基化或者 N 糖链被酶解所致，进一步结合N糖基化位点的特定 NX(XP)S/T结构域信息，我们初步推断该单抗中唯一可能发生糖基化的位点为：重链中氨基酸序列 EEQYNSTYR中的N位点，为了得到准确的定性结果，我们进行了后续的糖基化位点鉴定实验。 图4.单抗经过 trypsin 酶解和 LTQ-Orbitrap Elite 质谱实现的氨基酸序列覆盖度示意图(A为重链氨基酸序列覆盖示意图，B为轻链氨基酸序列覆盖示意图，其中绿色标记的氨基酸序列表示该段序列鉴定的可靠性非常高，达到99%以上，红色标记的氨基酸序列表示该段序列鉴定的可靠性为95%以下，无颜色标记的氨基酸序列表示该段序列没有被鉴定到，氨基酸序列上方的数字代表氨基酸的位置。) 3.3糖基化位点确定 经过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱数据采集和 Byonic 1.1 软件的数据库搜索，共鉴定到6个糖基化修饰的肽段，分别对应于 G0(…)、GOF()和G1F(°)(红三角表示岩藻糖，蓝方块表示N-乙酰氨基葡萄糖，绿圆表示甘露糖，黄圆表示半乳糖)等，每一条糖肽都经过人工确认，以其中的 EEQYN ( GOF ) STYR 糖肽为例，如图5所示，在二级质谱中，可以观察到6个糖诊断离子(见表5)和8个糖肽碎片离子(见表6)，同时结合N糖基化修饰位点的特定结构域信息，从而确证该肽段中天冬酰胺(N)残基为N-糖基化修饰位点。 由于采用了高分辨、高精度的LTQ-Orbitrap Elite 质谱，糖诊断离子的质量偏差都在1 ppm以内，除了个别碎片离子外，基本所有的糖肽碎片离子的质量偏差也都在1 ppm以内，由此可以判断该糖肽碎片离子的归属准确、可靠。 表 5. EEQYN ( GOF) STYR 糖肽经过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱鉴定到的糖诊断离子列表 表6.EEQYN (GOF) STYR 糖肽经过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱鉴定到的糖肽碎片离子列表(红三角表示岩藻糖；蓝方块表示N-乙酰氨基葡萄糖；绿圆表示甘露糖) 糖诊断离子 理论质核比/M+ 实测质核比/M+ CH，NO， 126.0549 126.0544 C，H，NO， 138.0549 138.0545 CH，NO， 144.0655 144.0657 CHNO， 168.0655 168.0647 CHNO， 186.0760 186.0755 CHNO， 204.0866 204.0858 糖肽碎片离子_ 理论质核比/M+ 实测质核比/M+ 439.2302 439.2312 y4 526.2625 526.2614 CH，NO 1272.5484 1272.5490 1392.5859 1392.5878 1538.6384 1538.5686 1595.6598 1595.6610 1757.7072 1757.7064 1919.7545 1919.6420 图 5. LTQ-Orbitrap Elite 质谱采集的 EEQYN ( GOF) STYR 糖肽的二级质谱图(红三角表示岩藻糖；蓝方块表示 N-乙酰氨基葡萄糖；绿圆表示甘露糖) 本文通过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱建立了单抗药物的整体分子质量测定、氨基酸序列鉴定和糖基化位点确认的分析方法，为常规单抗药物研发分析和实时生产检测提供了高效、快速的分析平台。实验结果表明 LTQ-Orbitrap Elite 组合式质谱仪，凭借其超高的分辨率，超快的扫描速度，超高的质量精度、超低的灵敏度和超大的动态范围，极大地完善和推动了单抗药物的鉴定分析。 Orbitrap 组 赛默飞小分子质学俱乐部 谱应用技术群 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermofisher.com 全国服务热线：8008105118 S CIENTIFIC 400 6505118(支持手机用户) AN_C_LCMSMS_21_201512Y SCIENTIFIC AThermo Fisher Scientific Brand