食用油、油脂中营养成分检测方案

作者 ( Ramon Hernande & Pablo Castillo Lab de Microbiologia de Andaluza Instrumentatcion 西班牙 ) ( Enrique Longueira & Jose Pineda ) Laboratorio Quimico Microbiologico， S.A. Murcia 西班牙 Rebecca Veeneman 安捷伦科技有限公司 2850 Centerville Road 采用自动样品制备测定橄榄油中的脂肪酸甲酯 (FAME) 应用简报 食品检测 摘要 测定橄榄油中的脂肪酸(FA)有多种不同的方法。本应用介绍了如何在碱性催化反应后进行分析以及使用安捷伦7696A WorkBench 样品制备工作台制备样品的优势。 前言 脂肪酸的分析在橄榄油工业中非常普遍且通常采用气相色谱分析。因为这类物质的强极性和高沸点，通常会得到较差的峰形和糟糕的重现性。为了避免这些问题，很多方法采用了衍生反应将脂肪酸变成脂肪酸甲酯(FAME)， 从而更容易实现色谱分离并得到更好的峰形。 衍生反应种类众多，其中最普遍的是使用正己烷和氢氧化钾(KOH) 在甲醇中进行行性催化反应。该方法快速、简单，可以得到游离脂肪酸无法获得的优异结果。 材料 所用试剂包括购自 Baker 公司的正庚烷(也可以采用正己烷)、甲醇(色谱纯)和氢氧化钾。将 11.2 g KOH 溶解在 100 mL甲醇中制备得到 2N 的KOH。 正庚烷和水用作7696A样品制备工作台的清洗溶剂。移取 KOH溶液的注射器必须用两种溶剂进行清洗，首先用水洗掉 KOH， 然后再用正庚烷清洗。移取正庚烷的注射器单独采用正庚烷进行清洗。 碱性衍生化分析橄榄油中脂肪酸的方法通常是在 20 mL 试管中加入100 mg样品，然后再加入10 mL 正庚烷和 100pL KOH。本研究对 WorkBench 样品制备工作台的应用进行了测试，工作台使用的样品瓶为2mL， 因此，所有试剂用量都缩小了10倍。 碱性催化反应为单一步骤，几分钟之内即可完成。样品制备工作台用于自动化制备所有进行 GC/MS分析的样品。 方法如下所示： 软件提供的资源管理器界面可以显示所有样品瓶和试剂的布局(见图1)。 图2显示了制备样品所用的方法。 图2. 安捷伦7696A 样品制备方法 结果和讨论 在其中一个样品瓶盘上，放置了三行2mL样品瓶，一行样品瓶装有正庚烷，一行装有 KOH，一行各装有一滴约10 pL 橄榄油(需分别称重示)。样品制备工作台使用两个注射器分别加入两种试剂：1mL正庚烷和10 pL KOH。都加入完成后，将样品瓶振荡10 min。 样品瓶混合完成后，取上层有机相进样到 GC， 配置250℃的分流/不分流进样口，和 MSD 相连。连谱柱为 HP88 (60m×250 um，0.2 pm)，柱流量1 mL/min。柱箱的程序升温为175℃保持5 min， 以5°C/min升到250℃，以获得最佳的脂肪酸分离效果。进样口采取 100：1的分流模式，所有分析均采用 SIM 和 SCAN两种模式进行采集。 为评估使用工作台制备样品的重现性和准确度，将10个工作台制备的样品注射进样到 GC/MS。表1列出了结果。 此应用报告对橄榄油中四种主要组分的结果进行了对比。色谱图如图3所示，各组分的峰面积见表2。 首先，对装有橄榄油样品的10个样品瓶进行称重，称重结果见表1. 表1. 10个样品的重量 这些样品瓶随后被放置在工作台的样品盘上，根据程序设定的加入量自动加入各试剂。一旦样品制备完毕，即按上述仪器条件注射进样到 GC/MS进行分析，图3为分析结果。 图3. SIM模式下的色谱图 表2. 橄榄油中四个主要组分的峰面积 棕榈酸甲酯 硬脂酸甲酯 油酸甲酯 亚油酸甲酯 样品 9.99 min 12.128 min 12.844 min 13.83 min 317343837.0 63331226.0 569320584.0 80584679.0 2 373510457.0 74825501.0 660064790.0 94609910.0 3 389137859.0 74174710.0 683431450.0 98106712.0 4 350160186.0 69553324.0 621849766.0 88281829.0 5 350311578.0 69513586.0 622622625.0 88233984.0 6 363692227.0 71973045.0 643859326.0 91639831.0 7 298792007.0 58778562.0 534781631.0 74997383.0 8 376569059.0 74878674.0 666439996.0 95109185.0 352698458.0 68424565.0 654254324.0 82569566.0 10 351745852.0 70145747.0 602155656.0 86951448.0 均值 350409359.2 69188856.3 622601967.1 87561952.4 相对标准偏差 27119463.9 5161865.2 46358289.5 7182432.9 %RSD 7.7 7.5 7.4 8.2 样品中四个组分单位橄榄油质量的峰面积见表3. 表3. 每毫克橄榄油中各组分的峰面积 棕榈酸甲酯 硬脂酸甲酯 油酸甲酯 亚油酸甲酯 样品 9.99 min 12.128 min 12.844 min 13.83 min 24600297.4 4909397.4 44133378.6 6246874.3 2 27873914.7 5583992.6 49258566.4 7060441.0 3 26293098.6 5011804.7 46177800.7 6628831.9 4 24155874.9 4796781.0 42886190.8 6088402.0 5 24669829.4 4895323.0 43846663.7 6213660.8 6 24740967.8 4896125.5 43799954.1 6234002.1 7 22635758.1 4452921.4 40513759.9 5681619.9 8 25273091.2 5025414.4 44727516.5 6383166.8 9 25557859.3 4958301.8 47409733.6 5983301.9 10 25863665.6 5157775.5 44276151.2 6393488.8 均值 25097420.2 4954369.4 44585290.7 6272059.8 相对标准偏差 1391411.9 284657.5 2430391.6 371694.7 %RSD 5.5 5.7 5.5 5.9 表4为10个样品中，每种 FAME的峰面积百分比。 表4. 每个组分所占的峰面积百分比 棕榈酸甲酯 硬脂酸甲酯 油酸甲酯 亚油酸甲酯 样品 9.99 min 12.128 min 12.844 min 13.83 min 30.8 55.2 2 31.0 54.9 3 31.3 54.9 4 31.0 55.0 5 31.0 55.1 6 31.1 55.0 7 30.9 55.3 8 31.0 54.9 9 30.5 56.5 10 31.7 54.2 均值 31.0 55.1 相对标准偏差 %RSD 本实验对两种剂量的试剂加入法——原剂量方法(100mg橄榄油) 和 WorkBench 工作台剂量方法进行了对比。采用此两种试剂加入法人工制备样品得到的结果分别见表5和表6。 表5. 使用原始试剂加入法得到的每毫克橄榄油中各组分的峰面积 棕榈酸甲酯 硬脂酸甲酯 油酸甲酯 亚油酸甲酯 样品 9.99 min 12.128 min 12.844 min 13.83 min 1 2674181.8 529275.8 4610749.8 674892.3 2 2562129.3 505970.3 4442449.3 648040.5 3 2596966.1 511187.6 4504510.0 655770.4 4 2388663.8 466760.2 4168008.4 601931.7 5 2721157.8 535230.9 4722598.6 688465.5 6 2789232.0 549999.6 4813189.6 704034.8 7 2330855.0 453164.1 4057061.6 589335.4 8 2645696.1 528725.3 4579552.0 669544.2 9 2650632.8 520264.3 4600138.2 668931.5 10 2660736.3 520639.8 4632201.2 671882.6 均值 2594658.8 510416.9 4501404.4 655410.2 相对标准偏差 142531.1 30276.4 236121.4 36110.5 %RSD 5.5 5.9 5.2 5.5 可以看到， %RSD结果与工作台自动化制备样品所得结果相近。 按与工作台制备样品相同的试剂量人工制备样品：将一滴橄榄油滴加到2mL样品瓶中，称重，使用安捷伦注射器加入1mL正庚烷和10pLKOH的甲醇溶液，人工轻微震荡混匀。分析结果见表6. 表6. 使用工作台剂量方法人工操作得到的每毫克橄榄油中各组分的峰面积 棕榈酸甲酯 硬脂酸甲酯 油酸甲酯 亚油酸甲酯 样品 9.99 min 12.128 min 12.844 min 13.83 min 24414278.4 4280301.6 34483064.7 5405051.1 21953969.5 4385041.9 34340981.7 5496525.8 3 25176754.2 4987565.4 39311102.4 6258162.4 4 23806050.0 4723341.1 36249791.4 5917479.9 5 23413864.7 4659269.7 36103230.9 5862013.3 22388861.8 4441774.0 34988087.2 5625015.1 7 23345774.4 4655270.9 36540218.6 5654628.9 21758664.6 4326697.7 31010500.3 5465899.5 22268704.8 4448969.7 34833834.8 5598507.6 10 21726270.7 4324528.6 34099881.5 5188441.0 均值 22970768.0 4513461.5 35078976.3 5633014.3 相对标准偏差 1194355.0 226067.9 2129375.1 301856.8 %RSD 5.2 5.0 6.1 5.4 如上所示，%RSD 值与使用工作台自动化制备样品的值相似。 结论 安捷伦7696A样品制备工作台是一款使用起来非常方便、简单、可靠的工具，可以自动化完成类似样品制备这样的实验室典型操作。本应用报告中的结果详细论证了使用工作台操作样品进行分析的重现性。无论是原始剂量试剂加入法还是工作台剂量试剂加入法，人工样品制备得到的结果与工作台自动化制备得到的结果非常相近。 更多信息 本文中的数据仅代表测定的典型结果。有关产品和服务的更多信息，请访问www.agilent.com/chem/cn。 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2012 2012年7月19日，中国印刷 5991-0761CHCN Agilent Technologies