饮料中维生素检测方案

Modern Preventive Medicine， 2012， Vol.39， NO.6 纳仪器nano instrument现代预防医学2012年第39卷第6期 Modern Preventive Medicine， 2012， Vol.39， NO.6 食品、多维片和饮料中12种维生素的高效液相色谱法同时测定 王希希1.2，胡燕1.3，孙成均 (1.四川大学华西公共卫生学院，四川成都610041；2.成都市疾病预防控制中心3.上海市浦东新区疾病预防控制中心) 摘要：目的 建立食品、多维片和饮料中水溶性维生素C、B，Bz， B， B12，烟酸、烟酰胺、叶酸和脂溶性维生素A、Ds、E、K的反相高效液相色谱同时测定方法。方法 样品中水溶性维生素经0.01 mol/L HCl 超声提取，脂溶性维生素经皂化法提取。饮品直接过滤后测定。色谱条件：色谱柱为C18柱，流动相为0.05 mol/L KH，PO4溶液(pH6.0)-甲醇，梯度洗脱流速1.1~1.5 ml/min；柱温40℃。结果 12种维生素标准曲线的线性范围： VC为0~5pg，烟酸为0~0.5pug， 其余均为0~1 ug；相关系数均大于0.996；相对标准偏差均小于5.0%；方法检出限为 0.073~0.193 ug/ml；加标回收率为75.5%~118.0%。结论 所建立的方法快速、简便、灵敏、准确，应用于复合维生素片、米粉、饮料中12种维生素的同时分析，取得了较好结果。 关键词：高效液相色谱法；维生素；多维片；米粉；饮料 中图分类号：R151.2 文献标志码：A 文章编号：1003-8507(2012)06-1514-05 Simultaneous Determination of 12 Water- and Fat-Soluble Vitamins inFoods and Drinks by High Performance Liquid Chromatography WANG Xi-xi*， HU Yan， SUN Cheng-jun. *West China School of Public Health， Sichuan University， Chengdu， Sichuan 610041， China Abstract： OBJECTIVE To establish a high performance liquid chromatographic method for the simultaneous determination ofwater- and fat-soluble vitamins including vitamin C， Bi， B2， Bo， Bi2， nicotinic acid， nicotinamide， folic acid， vitamin A，D3， E， and K in foods and drinks. METHODS Sample was extracted with 0.01mol/L HCl ultrasonically for water-solublevitamins and fat-soluble vitamins was extracted by Saponification. Drink samples could be analyzed directly after filtration. Thechromatographic conditions were as follows： the separation was performed on a Phenomenex Cis Gemini column (250x4.6mm，5pm) with methanol- KH，PO， buffer (0.05 mol/L， pH6.0) as mobile phase in a gradient at the flow rate 1.10 ml min 1 to1.50ml min-， with column temperature of 40℃. RESULTS The correlation coefficients for all the standard curves were greaterthan 0.996 in the range from 0-1.0pg(VC：0-5.00pg； Niacin： 0-0.5pg) and the detection limits ranged (S/N=2) from0.073 to 0.19pg/ml. The recoveries were from 75.5% to 118.0% with the relative standard deviations of 5.0%.CONCLUSIONThe method was applied to determine vitamins in multi-vitamin tablets， rice powder and drink with satisfactory results. Key words： High performance liquid chromatography； Vitamins； Foods； Drink 维生素是L一类性质各异的低分子量天然有机化合物，具有不同的生理功能、分子结构和理化性质，在生物体的生命活动中具有十分重要的作用，与人体的生长发育和健康密切相关；维生素的种类很多，按其溶解性可分为水溶性维生素和脂溶性维生素。目前维生素的测定方法主要有紫外光度法、荧光光度法2、气相色谱法3、高效液相色谱法(HPLC)[4-7]和高效毛细管电泳法18.9等。HPLC 不仅操作简便，重现性好，而且其温和的操作条件对于稳定性差的维生素也可得到准确的定量结果；但在多数应用 HPLC 法对维生素进行测定的文献中只是对其中一类维生素中的几种进行测定，对水溶性、脂溶性维生素进行同时测定的文献报道极少。本研究建立了反相高效液相色 ( 作者简介：王希希(1984-)，男，硕士 ) ( 通讯作者： 孙成均， E-m a il： sunchj2005@yahoo.com.cn ) 谱法同时测定了8种水溶性维生素和4种脂溶性维生素的方法，并应用于实际样品中测定，取得了较为满意的结果。 1材料与方法主要仪器与试剂 安捷伦 HP1100 高效液相色谱仪；色谱柱 (PhenomenexCis Gemini， 5 um， 4.6×250mm)；同类型保护柱(Phe-nomenex)。 甲醇(色谱纯)、盐酸(优级纯)、乙醇(分析纯)、无水乙醚(分析纯)、氢氧化钾(分析纯)、磷酸二氢钾(分析纯)，其他试剂除指明外均为分析纯。 维生素标准品： VC、VB、VB2、VB6、VBi2、烟酸、叶酸、VD3、VE标准品购自美国 Sigma 公司；烟酰标标准品购自上海伯奥生物科技有限公司；VK1标准品购自中国生物制品检定 所；VA(视黄醇)标准品购自美国Fluka 公司。 维生素标准储备液：分别别取维生素A、D3、E、K的标准贮备液(1mg/ml， 乙醇配制)，-18℃避光保存； VB、VBz、VB6、VB12、烟酸、烟酰胺标准备备液(1mg/ml，0.01 mol/LHCl配制)；叶酸标准贮备液i (1 mg/ml， 200 pl 5 mol/L KOH溶解后，再用0.01 mol/L HCl 定容)； VC临用新配(1 mg/ml，0.01 mol/L HCl配制)；储备液均储于-18℃冰箱中。临用新配维生素标准应用液。 实验用水为 Millipore 超纯水(18.2 MQ·cm)。脂溶性维生素A和E应用液浓度在测定前标定1101。 本实验中的多维片、强化米粉、玉米粉和饮料样品均购自本市超市。 实验方法 1.2.1 色谱条件 流动相： A：0.05 mol/L KH，PO4溶液(pH6.0)；B：甲醇；色谱线性梯度洗脱程序；柱温：40℃。见表1。 表1线性梯度洗脱程序(×10°) 时间(min) A(%) B(%) 流速(ml/min) 0.00 97.0 3.0 1.10 13.00 40.0 60.0 1.10 13.01 0.0 100.0 1.10 18.00 0.0 100.0 1.10 18.01 0.0 100.0 1.50 26.00 0.0 100.0 1.50 1.2.2 标准曲线的绘制 根据不同样品中维生素的含量范围，用标准储备液配制不同浓度的混合标准液，在高效液相色谱仪基线达平直后，进行测定并绘制标准曲线；维生素混合标准色谱图见图1。 注：1.维生素C (VC， 3.0 min)；2.烟酸(Niacin，5.3 min)；3.维生素B (VBi， 6.3 min)；4.维生素B。(VB6， 6.7 min)；5.烟酰胺(Nicotinamide，7.4 min)； 6. 叶酸 (Folic acid， 7.8 min)；7.维生素Bi2(VB12， 11.0 min)； 8.维生素 Bz (VB2，12.9 min)；9.维生素A(VA，18.7 min)； 10.维生素Ds (VDs， 21.1 min)；11.维生素E (VE，21.7min)；12.维生素K (VK， 24.9 min) 图1 12种维生素混合标准样品色谱图 1.2.3 样品处理 复合维生素片剂、米粉 准确称取 0.2g碾磨混匀的样品于15ml离心管内，加入10 ml 0.01 mol/L HCl，超声提取15 min 后12 000 r/min 离心5 min， 取上清液作为待测液A；再准确称取样品(碾磨均匀的复合维生素片0.7g或米粉4g)于250ml三角瓶中，加入20 ml乙醇，超声提取15min， 加入50%的KOH溶液(复合维生素片剂5ml；米粉10ml)， 90℃皂化 30 min， 皂化液用100 ml 乙醚萃取并于40℃水浴旋蒸至干，5 ml乙醇定容，此为待测液B；将同种样品的A 液与B液以体积比9：1混合作为测试液，20 pl进样分析；样品色谱图见图2、3。 饮料 取一定量经0.45 um 滤膜过滤后，20 pl进样分析。样品色谱图见图4。 图2某多维片样品色谱图 注：图中峰号同图1。 图3 某品牌米粉样品色谱图 注：图中峰号同图1。 图4 某饮料样品色谱图 1.2.4 样品测定与结果计算 在标准溶液测定相同条件下，对样液进行测定。以保留时间定性，读取各维生素峰面积。通过回归方程、样品称样量和提取液体积计算样品中各种维生素的含量(mg/kg)。 2结果与讨论2色谱条件的优化 2.1.1 色谱柱的选择 色谱柱对维生素的分离有很大的影响，试验了4种不同类型的反相Cg色谱柱 Phenomenex Gemini(250×4.6 mm， 5 um)、Phenomenex Luna (250×4.6 mm， 5pm)、Intex (150×4.6 mm， 5 pm)、MetaChem Polaris (250×4.6 mm，5 um)。实验表明； Phenomenex Gemini 实现了对上述物质的完全分离，故选择 Phenomenex Gemini 为分析用色谱柱。 2.1.2 梯度洗脱条件的优化 在文献[11]的基础上，选择甲醇和磷酸二氢钾缓冲液为流动相；因等度洗脱分离困难，采用梯 度洗脱方式。根据12种维生素色谱峰形、分离度和色谱分析时间，最终确定两种溶剂组成比例及梯度洗洗程序见表1。 2.1.3 流动相中缓冲液pH 值的选择 由于维生素的性质差别较大，流动相pH 值对其色谱分离有重要影响；缓冲液pH 值为4.0~8.0时，至少有2种维生素出峰时间发生重合；当pH为6.0时，12种维生素能够完全分离。 2.1.4 柱温的选择 实验表明，当柱温为30℃~40℃时，各维生素峰面积最大，但是在30℃时， VB 和VB。、烟酰胺和叶酸不能完全分离，且有峰展宽现象；柱温为40℃时，VB和VB6、烟酰胺和叶酸达到完全分离且峰形较好；温度50℃时，VC 峰面积明显变小，且VB，和VB6、烟酰胺和叶酸峰重合；因此，选择40℃为色谱分离柱箱温度。 2.1.5 流速的选择流动相固定后，流速的选择会影响色谱分离，由于水溶性、脂溶性维生素性质不同，因此在分析过程中选择了不同的流速见表1。 2.1.6检测波长的选择88种水溶性维生素的最大吸收波长相近(见表2)，由于VB与VB6、烟酸与叶酸的峰分离时间间隔较短，难以完成波长切换，为确保方法灵敏度，将VB、VB6、烟酰胺、叶酸的检测波长都设为266 nm；其余均为其最大吸收波长。检测波长切换程序见表3。 测定液中乙醇含量对测定的影响 在维生素混合标准液中，乙醇含量对VA 峰面积有增大作用，其余11种维生素峰面积不受其影响。但当乙醇含量超过10%时，烟酸峰形开始分叉，随着乙醇比例的提高， VB、VB。的峰形和分离度也受到影响；进样量太大，烟酸、VB、VB6、烟酰胺和叶酸的峰形都也有变差的趋势。故在测定液中需固定 乙醇含量在一定的范围。 2.3 方法性能评价 2.3.1 线性范围和检出限 在优化的色谱条件下，本法的线性回归方程、最低检出限、保留时间和峰面积的相对标准差见表4。 表2 12种维生素的最大吸收波长(nm) 维生素 最大吸收浓度 维生素 最大吸收浓度 VC 266 VB 360 Niacin 266 VB2 266 VB： 266 VA 325 VB6 291 VD： 265 Nicotinamide 266 VE 295 Folic acid 278 VK 254 表3检测波长切换程序 时间(min) 检测波长(nm) 0.00 266 10.00 360 12.00 266 18.00 325 20.00 265 21.50 295 23.00 254 表4方法的回归方程、线性范围、检出限和重现性(n=5) 维生素 线性范围(pg) 回归方程 检出限(ug/ml) 相对标准偏差"(%) 相对标准偏差"(%) VC 0~5.0 y=4.432x-27.53 0.999 0.073 0.82 4.20 VB： 0~1.0 y=1.470x-3.764 0.999 0.094 0.76 2.32 VBz 0~1.0 y=4.015x+28.74 0.998 0.087 1.12 3.14 VB6 0~1.0 y=0.734x-2.163 0.999 0.170 1.33 3.29 VB12 0~1.0 y=1.016x-0.096 0.999 0.116 1.24 2.55 Niacin 0~0.5 y=1.417x-3.469 0.999 0.134 1.62 3.46 Nicotin-a mide 0~1.0 y=1.344x-0.669 0.999 0.076 1.78 2.13 Folic acid 0~1.0 y=2.435x-0.957 0.999 0.086 1.76 4.38 VA 0~2.0 y=2.397x-2.910 0.999 0.093 0.82 3.02 VD3 0~0.4 y=1.13x-1.812 0.999 0.134 0.91 2.44 VE 0~1.0 y=0.145x+0.433 0.999 0.193 1.26 3.95 VK 0~1.0 y=0.938x+1.108 0.999 0.162 1.48 3.21 注：保留时间的 RSD；峰面积的RSD。 2.3.2 精密度 本法峰面积的日间精密度范围为1.35%~4.11%。样品测定精密度测定 RSD 范围为 0.92%~4.80%。 2.3.3 准确度 由表5、6可见，本法在多维片、米粉和饮料样品中各维生素的加标回收率范围是75.5%~129%。 2.4 方法应用 应用本法测定了复合维生素片、米粉、饮料、玉米粉中水溶性和脂溶性维生素含量，结果见表7、8。 综上，本文报道的食品和饮料中多种维生素的反相高效液相色谱同时测定方法，实现了一次处理、同时分析12种不同性质维生素的目的，具有一定的实际应用价值。 ( 参考文献： ) ( 1 ] 周其镇，殷龙彪，曾前东.CPA分光计算法同时测定多种维生素的研究 [J].药学学报，198 7 ，22(12)：896-900. ) ( [2 ] 任 一 平，陈恒武.柱后光化学衍生荧光检测高效液相色谱法测定食品中的维生素B [J].分析化学，2000，28 ( 5)：554-558. ) ( [ 3 ] T a n a k a A， L ijima M， K i kuc hi Y . Gas chromatographic de t ermina- tion of nicotinamid e i n meats and meat products as 3-cyanopyridine [J ] . Journal of Chromatogra p h y A ， 198 9 ，466(1)： 3 07-317. ) 表5多维片与米粉样品中维生素的回收率(n=3，x10²) 注： ND： not detected， -： not tested。 表6饮料中维生素的加标回收率实验(n=3，×10²) VB， 维生素饮料(/20p1) 1.130 本底值 (pg) 加入量 (pg) 测定值 (pg) 回收率 本底值 (pg) 加入量 (ug) 测定值 (ug) 回收率 102 1.940 116 VC 216.4 437.7 92.8 99.4 105 5.040 100 VB： ND 0.940 0.990 105 Niacin 5.040 1.830 97.3 ND 1.600 1.890 118 2.820 2.720 3.210 3.350 104 VB2 96.5 4.810 4.940 103 ND 96.8 Nicotinamide 3.210 0.510 3.750 106 1.590 86.0 1.020 3.980 75.5 2.150 77.3 1.530 4.480 83.0 1.390 2.640 108 Folic acid ND 0.540 0.500 92.6 2.780 3.810 96.4 1.080 1.070 99.1 4.180 5.280 99.3 1.620 1.540 95.1 注： ND： not detected；； -： not tested. 表7 维生素饮料测定结果(n=6) 维他命 标示值 测定值 VC 25~50 33.4~42.6 VB6 0.04~0.12 0.08~0.10 VBi2 0.06~0.18pg ND Nicotinamide 0.33~1.0 0.86~0.92 VE ND 注：一：没有标示的量， ND： 没有检测到的量。 ( [ 4 ] K lejdus B o rivoj， Pe t rlová Jitka， Po t esil Dav i d. 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Journal of Chromatograp h y A， 2007 ， 1173 ( 1-2)：71 - 80. ) 多维片( per tablet) 米粉(/100g) 维生素 标示值(mg) 测定值(mg) 标示值(mg) 测定值(mg) VC 25.0 24.8~25.2 ≥40.0 45.4~50.4 VB 2.50 2.53~2.60 ≥0.60 1.36~1.54 VB2 2.50 2.66~2.85 ≥0.60 0.84~1.12 VB 0.25 0.13~0.15 ≥0.30 2.0~2.4 VBi2 0.50pg ND ≥0.80pg ND Niacin ND ≥4.50 3.97~4.05 Nicotinamide 7.50 7.56~7.80 ND Folic acid ND ≥20.0pg ND VA 825pg 1.10~1.13 ≥478.5pg 699~752pg VD 5.0pg ND ≥7.50pg ND VE 5.00 5.11~5.16 ≥4.47 5.02~5.39 注：： 一： not labeled， ND： not detected。 ( [ 6] Jedlick a A . a n d J. K l imes. Dete r m i nation of w a ter- an d fa t -soluble v i tamins i n different matrices using high-performance l i quid c h ro- matography [ J] . ChemInfor m ， 2005 ， 36 (42)： 1 522-2667. ) ( [7 ] H. B .Li and F . Ch e n. Si m ultaneous de t ermination o f t w elve water- and f at-soluble v i t amins by h i gh-performance li q uid c h romatogra-phy w ith d iode a rray de t ection [ J [J ] . Chromatographia， 2001， 5 4 (3)：270-273. ) ( [8 ] M.M. 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