草莓中农药残留检测方案(气相色谱仪)

应用简报 Agilent食品检测Trusted Answers 使用Agilent 8860 GC 与 Agilent5977B GC/MSD 和 SureTarget解卷积工具对草莓进行农药筛查 Anastasia A. Andrianova，Bruce D. Quimby，Jessica L.Westland安捷伦科技有限公司 利用 Agilent 8860 GC 与 Agilent 5977B GC/MSD 系统对草莓中的农药进行筛查。这套经济有效的系统与适当的样品前处理、操作条件和软件工具相结合，为鉴定复杂基质(如食品)中的农药及其他污染物提供了一种实用的方法。该仪器配置将脉冲不分流进样、不锈钢El离子源和保留时间纳入农药和环境污染物数据库中。完整分析分两个步骤完成。首先使用 Agilent MassHunter 未知物分析软件对样品进行筛查。该软件提供了自动化解卷积和谱库搜索功能，可鉴定任何目标农药或其他相关化学物质。然后，基于筛查结果分析样品以定量发现的任何目标化合物。利用购自当地杂货店的草莓样品来证明该方法的能力。 前言 食品供应中的痕量农药和环境污染物仍然是全球关注的问题，这使研究人员对更快速、更可靠分析方法的需求不断增加。挑战在于找出能够筛查复杂食品基质中的数百种农药、多环芳烃(PAH)及其他目标物的技术。通常，分析方法针对的是食品中常见的特定化合物列表。这些方法可能很有效，但可能会忽略非特异性靶向的残留物。 本方法旨在使用多步法找出尽可能多的目标化合物。第一步是利用GC/MSD 系统在保留时间锁定 (RTL) 至包含1000多种化合物的农药和环境污染物谱库的情况下获得样品的质谱扫描数据。然后在Agilent MassHunter 定量分析10未知物分析软件中对扫描数据进行处理，该软件可提供简化的自动化解卷积和谱库搜索功能。先前用于处理扫描数据以进行谱库扫描的方法，依赖于对经过基线扣除的峰的峰顶点谱图与参比谱图进行比较。当色谱峰不存在色谱干扰时，该方法非常有效。但是，食品样品中通常包含大量基质化合物，这些化合物会干扰分析过程，从而使分析物鉴定具有挑战性。 质谱解卷积是一种长期使用的从分析物质谱图中去除共洗脱化合物离子的软件方法。在解卷积中，在扫描范围内的所有质量处提取离子色谱图。将具有相同峰形和保留时间(RT)的色谱峰的离子分为各种组分。使用与色谱积分仪类似的过程，将多个重叠峰中存在的离子响应分配至每个 峰。然后根据组分创建质谱图。解卷积过程大大减少或消除了分析物质谱图中的干扰离子。 MassHunter 定量分析10未知物分析软件具有一组功能强大的工具，可以对扫描文件中的质谱图进行解卷积，并在谱库中搜索组分。然后，将谱库匹配得分较高的峰作为可能的匹配结果进行检查。如果谱库中包含 RT 或保留指数(RI)信息，则这些信息可用于筛选搜索结果，并进一步证明化合物的存在。一般而言，谱库匹配得分 (LMS)越高， RT匹配度越接近，化合物存在的可能性就越高。利用包含在 RTL 条件下采集的 RT 或 RI质谱库以及锁定至相同时间范围的扫描数据，能够最有效地完成这一筛查。借助 RTL， RT与谱库内的 RT 的差异通常在 0.1分钟以内甚至更小。本应用简报将包含1000多种化合物的质谱库(其RT锁定至安捷伦农药与环境污染物 MRM数据库和Agilent MassHunter 农药个人化合物数据库与谱库(PCDL)) 与 GC/Q-TOF工作流程相结合。MassHunter 未知物分析软件可在几分钟内自动处理完整的扫描文件，并生成 LMS 和 RT 匹配数据的报告，然后检查该报告以确定存在的化合物。 通过在 NIST 谱库中搜索解卷积的组分，可完成进一步筛查。NIST 17谱库包含在本研究中用于许多条目的半标准非极性色谱柱上通过过验确定的RI。利用 RTL 农药方法运行烷烃RI校准混标，并用其创建RI校准文件。然后， MassHunter 未 知物分析软件在 NIST 17 中搜索解卷积的质谱图，并列出匹配结果的 LMS 和RI值以及 NISTRI值(如有)。此工具非常强大，但是由于它搜索所有基质组分，因此可能导致需要检查的匹配结果列表很长。 一旦根据样品筛查确定了化合物列表，即可创建一种单独的方法，用于定量分析目标化合物以及待监测的任何其他化合物。 为证明该方法的实用性，从美国加利福尼亚州库比蒂诺周围的多家杂货店和农贸市场购得16个草莓样品，并利用该方法进行分析。草莓通常需要使用农药才可成功长成合格产品。利用 QuEChERS 方法萃取草莓样品，以乙腈作为溶剂得到提取物。 考虑到许多农药具有活性，因此应当优化进样口和进样技术的选择。在本例中，发现脉冲热不分流进样可提供良好的分析结果。对于所用的色谱柱，不适合使用乙腈作为溶剂通过脉冲热不分流进样至GC中。经常出现峰形较差的问题。该方法使用低压降 (LPD)进样口衬管并更改柱温箱的初始温度和保持时间，可解决这些问题。 为防止后续运行中在分析物之后洗脱的高沸点基质污染物产生鬼峰，延长了烘烤时间。连续使用时，沸点最高的污染物会沉积在柱头，导致RT漂移、峰形变差和响应降低。这个问题可通过修剪色柱头并使用 RTL 软件工具重新锁定 RT而得到解决。 本研究所用的系统被配置用于鉴定草莓提取物中的农药。所用的重要技术包括： 脉冲不分流进样：借助脉冲不分流进样，在进样过程中流过进样口和色谱柱的流量增加。与正常的不分流方式相比，增加的流量将分析物更快地吹扫出进样口，从而减少分析物在进样口高温下的暴露。这样减少了活性农药的分解 RTL： RTL 是安捷伦提供的一项功能，其中在系统上运行锁定化合物(在本例中为甲基毒死蜱)，软件确定为得到与锁定条件下采集的质谱库完全相同的 RT 所需的色谱柱流速。此功能可在多种仪器和平台上为农药提供几乎相同的RT，从而使数据分析和方法维护更加轻松。在筛查过程中，精确RT 是一种实用的筛选工具 质谱解卷积： MassHunter 定量分析10未知物分析软件中的质谱解卷积功能提供了一种自动化方法，该方法使用谱库匹配得分和精确 RT 匹配(如有)快速鉴定高基质样品中的化合物 图1示出本研究所用的系统配置。 表1列出了仪器操作参数。利用脉冲不分流进样，可将农药(尤其是活性农药)最大程度地转移至色谱柱中。最初，由于使用乙腈作为进样溶剂，分析物峰形出现问题。已知乙腈在不分流进样至所用的半非极性色谱柱中会带来麻烦。安捷伦单锥超高惰性不分流衬管(部件号5190-2293)(图2的上图)广泛用于不分流进样，并 适合与大多数常见的 GC 溶剂一起使用。但是，使用乙腈时，脉冲不分流进样绘使每种分析物产生多个峰。实验发现，将安捷伦超高惰性通用低压降进样口衬管(部件号5190-2295)(图2的下图)与调整初始柱温和保持时间相结合，能够消除这一问题。在所有后续分析中，均使用该方法。请注意，这个问题与体积相关，此处将进样量限制为1.0 pL。 图 1. Agilent 8860 GC 和 Agilent 5977B GC/MSD 系统的配置 超高惰性不分流进样口衬管，部件号5190-2293 样品前处理 从当地的零售商店和农贸市场购得16种不同包装的有机和非有机草莓。将草莓切成小块，冷冻，并在液氮下混合(首先将有机样品混合)。所用的 QuEChERS样品前处理方法如下。称取10g各个样品置于50mL离心管中。将两粒陶瓷 均质子加入每个离心管中，然后向每个离心管中加入10 mL 乙乙 (HPLC级)。在1500次冲程/分钟下，将样品机械振摇3分钟。将 EN 方法15662 QuEChERS 萃取盐包(部件号5982-6650)加入每个离心管中。在1500次冲程/分钟下，将样品机械振摇3分钟，然后在5000rpm 下离心5分钟。将6mL提取物转移至QuEChERS 分散 SPE 15mL管(一般水果和蔬菜，部件号5982-5056)中。在1500次冲程/分钟下，将样品涡旋混合3分钟，然后在5000rpm 下离心5分钟。然后将样品提取物转移至带标记的自动进样器样品瓶中进行分析。 色谱柱 类型 Agilent J&W HP-5ms 超高惰性木(部件号19091S-433UI) 长度 30 m 直径 0.25 mm 膜厚 0.25 pm 控制模式 恒流 流速 1.374 mL/min 进样口连接 分流/不分流 出口连接 MSD MSD 氦气 型号 Agilent 5977B GC/MSD 离子源 不锈钢 真空泵 高性能涡轮泵 调谐文件 Atune.U 模式 扫描 扫描范围 45-550 amu 溶剂延迟 4分钟 电子倍增器电压增益模式 1.0 TID 开 四极杆温度 150°C 离子源温度 280℃ 传输线温度 280°C 平衡时间 0.25分钟 筛查扫描数据：RTL农药谱库 图3示出样品21提取物的扫描总离子流色谱图(TIC)。尽管 QuEChERS 萃取过程可有效地回收草莓中的农药，但它仍然带来了许多基质化合物，如图3所示。 然后，通过MassHunter 未知物分析软 件运行提取物21的扫描文件，在 RTL 农药谱库中搜索解卷积的组分。图4示出生成的报告。该报告可以按任意列进行排序，此处显示为按 LMS 递减排序。以第五项环酰菌胺为例，它具有较高的LMS (91.9)， 其 RT处于 RTL 谱库中RT的0.0619分钟以内，因此存在该化合物的可信度很高。该报告显示，9种农药的LMS 值均大于65， 且RT匹配度接近。图5示出提取物21 的 TIC的一部分，其中鉴定出的组分显示为绿色，而环酰菌胺组分显示为红色。 TIC 表明，存在与环酰 菌胺共洗脱的大量基质干扰物质。 图3.样品21的提取物的 TIC Components ComponentRT Compound Name MatchFactor DeltaRT Fommula Base PeakArea 9.9284 Tetrahydrophthalimide， cis-1，2，3，6- 96.9 0.0756 C8H9NO2 71101.6 20.8760 Cyprodinil 96.7 0.0270 C14H15N3 61475.7 23.3407 Fludioxonil 96.6 0.0513 C12H6F2N202 15070.2 16.1407 Pyrimethanil 94.2 0.0153 C12H13N3 66782.7 26.1321 Fenhexamid 91.9 0.0619 C14H17CI2N02 35885.2 21.3895 Captan 89.1 0.0395 C9H8CI3NO2S 13758.1 19.3621 Di-n-butylphthalate 86.4 0.0199 C16H2204 6234.7 12.3959 Flonicamid 85.0 0.0131 C9H6F3N30 5788.6 8.2805 Novaluron 84.4 0.0425 C17H9CIF8N204 2973.1 20.7134 Sulfur (S8) 80.5 -0.1854 S8 4940.3 10.4643 Cashmeran 75.9 0.0377 C14H220 249203.7 17.5668 Diisobutyl phthalate 73.5 0.0152 C16H2204 2909.3 28.2554 Bifenazate 70.8 0.0706 C17H20N203 949.3 12.8967 Benzophenone 69.4 0.0223 C13H100 4619.0 5.0282 2.4-Dimethylphenol 67.3 -0.0732 C8H100 3014.1 12.1536 Diethyl phthalate 65.3 0.0194 C12H1404 5618.9 图6示出在 MassHunter 未知物分析软件 中检查匹配结果(在本例中为环酰菌胺)时所示的信息。图6A将软件鉴定为质谱图的一部分的离子的 EIC 叠加。检查该叠加图，查看 EIC 是否具有与此处所示相同的峰形和 RT。图6B的质谱图是该峰组分曲线上的原始谱图的平均值。目的是显示来自共洗脱化合物的干扰离子的干扰程度。该质谱图表明存在干扰物质，如图5中的 TIC 所示。 图6C 示出在环酰菌胺的 RT 处发现的组分的解卷积质谱图与反向谱库参比谱图的比较。解卷积过程去除了干扰离子，产生了91.9的高质量 LMS。考虑到精确的时间匹配，样品21中存在环酰菌胺的可信度很高。 “基峰面积”项还可以用于指示列出的匹配结果的响应的相对大小。通常，将忽略LMS得分低于65的化合物，除非该化合物是重点关注的化合物。 为说明对具有边际 LMS 的匹配结果的检查，样品提取物19中的环酰菌胺含量大大低于样品21中的含量。图7示出MassHunter 未知物分析软件中显示的匹配结果的质谱图信息。仅基于谱图匹配得分，该匹配结果可能会被拒绝。但是，由于三种主要离子以大致正确的比例存在，且RT与 RTL 谱库中 RT的差异在0.066分 钟以内，因此，该匹配结果可能值得添加到待定量分析的化合物列表中。 筛查扫描数据：NIST 17谱库 包含1000 多种化合物的 RT 谱库便于筛查，因为 RT匹配度非常出色，且待检查的匹配结果数量有限。但是，在某些情况下可能需要更大范围的筛查，例如在评估新供应商的情况下。 MassHunter 未知物分析软件还可用于在包含超过260000幅质谱图的 NIST 17 谱库搜索解卷积的组分。 NIST 17 包含在本 文用于许多条目的半标准非极性色谱柱上通过实验确定的RI。利用 RTL 农药方法运行烷烃RI校准混标，并用其创建RI校准文件。然后， MassHunter 未知物分析软件在 NIST 17 中搜索解卷积的质谱图，并列出匹配结果的 LMS和RI值以及NIST RI值(如有)。这是一种非常强大的工具，但是由于它搜索所有基质组分，因此可能导致需要检查的匹配结果列表很长。例如，草莓提取物的筛查通常会产生400多个 LMS 值>65的匹配结果。 图8示出由 NIST 17 得到的提取物21的筛查结果的一部分。使用烃类RI校准计算出组分RI。谱库RI 取自 NIST 条目，为半标准非极性相的实验RI(如有)或根据分子参数计算出的理论值。请注意，后者的价值有限，因为预测RI的误差通常很大。 审查 NIST 17结果时，考虑到 LMS和△RI值。如果 LMS较高， △RI占RI的一小部分，且 NIST RI 通过实验确定，则有确凿的证据表明该化合物存在。 NIST 17 筛查可用于多种用途： 确认通过 RTL 农药谱库筛查发现的化合物的鉴定结果 查找具有可疑的 LMS 值的 RTL 筛查匹配结果的替代鉴定结果 鉴定 RTL 筛查未鉴定出的目标化学物质 在图8中，发现环酰菌胺具有较高的LMS值(93.7)，但相比于 RI2349， △RI值(估计的类型)较大，达到159。在本例中，由于LMS 很高且估计的谱库RI值 不确定，因此认为可能存在环酰菌胺。RTL 农药谱库筛查已确认存在该化合物。NIST 17 搜索结果还表明，嘧菌环胺、嘧霉胺和咯菌腈具有非常高的 LMS值和非常低的实验型△RI值，从而确认了通过RTL农药谱库筛查鉴定出的这些化合物。在审查提取物19的 NIST 17 搜索结果时，列出了被鉴定为沙林的匹配结果，其LMS 为 78.1。这一 LMS值足够高，需要由数据审查人员进行进一步检查。由于沙林是一种化学战剂，因此如果它存在于食品中，将受到最高程度的关注。 Components ComponentRT Compound Name MatchFactor CAS# Fommula Component RI Library RI Delta RI Base PeakArea 10.4643 2.4-Ditert-butylphenol 99.0 96-76-4 C14H220 1512 1519 7 249203.7 8.6566 2，4.7.9-Tetramethyl-5-decyn-4，7-diol 98.9 126-86-3 C14H2602 1414 1407 -7 89233.1 37.3234 Vitamin E 98.9 59-02-9 C29H5002 3137 3136 -1 328658.4 29.2587 Bis(2-ethylhexyl) phthalate 98.7 117-81-7 C24H3804 2548 2529 -19 169492.9 39.6297 .qamma.-Sitosterol 98.6 83-47-6 C29H500 3321 3321 0 425291.4 20.8760 Cyprodinil 98.2121552-61-2 C14H15N3 2045 2037 -8 61471.9 11.5135 1，6.10-Dodecatrien-3-ol，3，7.11-trim... 98.2 40716-66-3 C15H260 1565 1564 -1 38323.6 6.1720 Benzene， 1，3-bis(1.1-dimethylethyl) 98.1 1014-60-4 C14H22 1256 1249 -7 482927.1 39.8264 Stigmasta-5，24(28)-dien-3-ol，(3.bet... 98.1 481-14-1 C29H480 3337 3343 6 350648.9 9.9284 1，2，3，6-Tetrahydrophthalimide 98.1 85-40-5 C8H9NO2 1483 1470 -13 71101.6 4.2235 Benzaldehyde， 4-methyl- 97.1 104-87-0 C8H80 1085 1079 -6| 35691.6 16.1407 Pyrimethanil 96.9 |53112-28-0 C12H13N3 1797 1793 -4 66788.4 23.3407 Fludioxonil 96.3 131341-86-1 C12H6F2N202 2183 2169 -14 15070.2 36.2745 .gamma.-Tocopherol 95.7 7616-22-0 C28H4802 3054 3074 20 70828.8 17.2976 Acetic acid， 10.11-dihydroxy-3.7.11... 94.6 1000194-28-5 C17H3004 1856 2103 247 80191.2 22.0848 Phytol 93.9 150-86-7 C20H400 2111 2114 3 34328.4 5.6150 Benzofuran， 2.3-dihydro- 93.9 496-16-2 C8H80 1214 1224 10 159798.8 4.4648 Benzene， 1-isocyano-3-methyl- 93.9 20600-54-8 C8H7N 1110 17760.3 26.1321 Fenhexamide 93.7126833-17-8 C14H17CI2NO2 2349 2508 159 35885.2 9.5096 Dodecane，4.6-dimethyl- 93.7 61141-72-8 C14H30 1461 1325 -136 47311.5 33.2985 Squalene 93.3 111-02-4 C30H50 2828 2832 4 41092.9 nnn nnnnr Anii4nAn 4n nnr annnrn 图8.样羊 21 在 NIST 17 谱库中的搜索结果 Components Component RT Compound Name Match Factor CAS# Fomula Component RI Library RI Delta RI 8.0918 4-Chlorobutyric acid， 4-isopropylphenyl ester 58.2 100035.. C13H17CI.. 1382 1813 431 518.2 8.1053 Octanoic acid，4isopropylphenyl ester 65.8 100033. C17H2602 1382 1905 523 531.8 8.2121 5t-Butyl-4-methylimidazole 56.6 146979-.. C8H14N2 1389 1140 -249 1145.0 8.3395 Sarin 78.1 107-44-8 C4H10FO2P 1397 820 -577 3723.8 8.3507 Undecane，4.7-dimethyl- 79.2 17301-3... C13H28 1397 1185 -212 19703.0 8.3507 Tetradecane 92.4 629-59-4 C14H30 1397 1400 3| 19703.0 8.3789 Dimethyl-(allyl)-silyloxybenzene 56.9 66998-6... C11H16OSi 1399 1232 -167 279.8 8.4180 3.5-Dibutoxy-1.1.1.7.7.7hexamethyl-3，5-bis... 61.3 72439-8... C20H540... 1401 2001 600 1302.9 0A775| CCCc A17N0A7 C12U7n 1A07bl 120C ac C7075 图9.提取物 19在 NIST 17 谱库中的搜索结果 图10 示出 MassHunter 未知物分析软件中显示的信息。 沙林的谱库谱图中仅含两种重要的离子，且它们的质量数相当常见。这两种离子主导了LMS计算，得到78.1分。RI值与实 测值(实验)RI之间也存在很大差异。基于RI值和相对较差的谱图选择性，最终可以排除沙林的存在。 还将草莓样品的提取物用于一项独立的实验中③，该实验对筛查过程中发现的农药 进行定量分析。通过对筛查结果与定量值进行比较，可以估算通过筛查过程得到鉴定所需的农药的含量。 组分RT： 8.3395 表2包含在草莓提取物中鉴定出的农药、USEPA 规定的草莓中农药残留最大浓度容许量[4.5]以及通过筛查得到鉴定所需的估算含量。草莓样品中存在的所有农药均可以在容许浓度或更低浓度下得到鉴定。 Agilent 8860 GC 与 Agilent 5977B GC/MSD系统提供了一种经济有效的鉴定草莓中农药的方法。脉冲不分流进样可在所需的水平上实现适当的样品惰性转移。通过首先使用提供自动化解卷积和谱库搜索功能的Agilent MassHunter 未知物分析软件在扫描模式下筛查样品提取物，i可以检出农药或其他目标化学物质。 使用 RTL 还可轻松地对结果与利用其他仪器和 MS类型获得的结果进行比较。使用安捷伦农药与环境污染物 MRM 数据库，可以对通过此系统检出的任何目标化合物与通过 GC/MS/MS 获得的结果进行比较。还可以对它们与通过 GC/Q-TOF和Agilent MassHunter 定量分析软件以及精确质量农药个人化合物数据库和谱库(PCDL) 获得的结果进行比较。利用多种平台，为解决食品安全需求提供了一套强大的工具包。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( 2019年10月7日， 中国出版 ) 表2.利用该方法实现鉴定所需的估计农药 ppb 化合物 容许许度 (ppb) 实现鉴定所需的 ppb 嘧菌酯 10.000 600 联苯肼酯 1500 500 联苯菊酯 3000 100 克菌丹 20000 2000 顺式-1，2，3，6-四苯邻苯二甲酰亚安 25000 500 嘧菌环胺 5000 100 乙螨唑 500 300 环酰菌胺 3000 300 氟啶虫酰胺 1500 300 咯菌腈 2000 100 马拉硫磷 8000 150 甲霜灵 10000 100 腈菌唑 500 500 双苯氟脲 500 500 嘧霉胺 3000 100 喹氧灵 900 100 氟醚唑 2500 150 肟菌酯 1100 150 ( 参考文献 ) ( 1 Westland， J.； Stevens， J . 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