肝脏组织提取物中脂质检测方案(液相色谱仪)

Mark Sartain 和 Theodore Sana 安捷伦科技公司 美国加利福尼亚州圣克拉拉 色谱对肝脏组织提取物中脂质分析的影响 应用简报 前言 脂质组学属于新兴研究领域，其核心工作是生物系统中各种脂类物质的表征和定量分析。质谱法是否能够成功检测和鉴定出给定样品中的数千种潜在脂质，将直接取决于脂质液相色谱分离的策略。 肝脏、脑、心脏组织提取物是脂质组学研究中常见的生物样品。为证明色谱对脂质组学分析的影响，本应用简报以肝脏组织提取物为例，总结了使用反相(RP)和正相(NP)色谱分离不同类型脂质的优势。 本研究工作采用Agilent UHPLC 1290系统(包括二元泵、多孔板自动进样器和柱温箱)进行。液相色谱通过安捷伦喷射流接口与 Agilent 6540 Q-TOF联用。采用反相和正相色谱两种方法分离组织提取物。 方法 色谱系统 正相液相色谱条件 色谱柱 Agilent Z0RBAX Rx-Sil 柱， 2.1×100mm， 1.8 pm (部件号828700-901) 柱温 25°C 进样量 5.00 pL 自动进样器温度 4°C 注射针清洗 放入清洗口15秒 (50：50甲醇/异丙醇) 流动相 A) 58：40：2异丙醇/己烷/水，含5mM乙酸铵 和0.1%乙酸 B) 50：40：10 异丙醇/己烷/水，含5mM乙酸铵 和0.1%乙酸 流速 0.300 mL/min 梯度程序 时间 B(%) 0.00 0 5.00 0 34.00 100 36.00 100 38.00 0 停止时间 38 min 后运行时间 5min 质谱 Agilent 6540 Q-TOF， 配有双安捷伦喷射流离子源 仪器模式 2GHz， 宽动态范围， m/z1，700 极性 正离子或负离子 干燥气温度 300°C 干燥气(氮气) 11 L/min 雾化器压力 35 psi 鞘气温度 300°C 鞘气流速 12 L/min 毛细管电压 3，500 V(+)， 3，000V(-) 喷嘴电压 0V 碎裂电压 150 V Oct 1 Rf Vpp 750V 采集速度 仅MS：每秒1张张图(MS) 自动MS/MS：每秒3张谱图(MS)， 每秒3张谱图 (MS/MS) 自动 MS/MS参数 分离峰宽：窄(约1.3 amu) 碰撞能量：20eV 参比校正 2点：m/z 121.050873(+)， m/z922.009798 (+) 从肝脏组织提取到的脂类物质的分布情况 肝脏总脂质提取物成分 肝脏总脂质提取物购自 Avanti PolarLipids 公司(亚拉巴马州阿拉巴斯特)，脂质成分组成见上图 将冻干的脂质提取物物溶于2：1氯仿/甲醇溶液，然后用流动相A稀释至200 ng/pL 进样量5pL (含1pg提取物)，进行反相或正相液质联用分析(见方法部分) 分析工作流程中数据分析的第一步是从结果中提取分子特征，该特征由保留时间和质量数确定。此特征将化合物的所有特定加合物和同位素的丰度浓缩为单个化合物的丰度。分子特征提取由 Agilent MassHunter定性分析软件(版本B.07.00) 通过 Agilent 分子特征提取器(MFE)算法进行，脂质标注通过 Agilent METLIN 脂质 PCDL (B.07)和 SimLipid 软件(版本4.20， PREMIERBiosoft公司，加利福尼亚州帕罗奥图) 进行。METLIN 脂质 PCDL 包含640张通过 化学标准品获得的MS/MS 谱图。 SimLipid软件支持脂质谱图的 MS/MS 理论匹配且包含36，224个脂质条目。 结果与讨论 我们采用 MFE 算法对反相色谱法分离的肝脏脂质提取物进行分析，得到了4，108种提取化合物(特征)。然后我们在 METLIN数据库中搜索化合物，得到1，000余种带有脂质标注的化合物，单次液质联用分析仅耗时38分钟(图1). 图1.提取化合物色谱图(ECC)的叠加，对应1，061种已标注化合物，仅通过单次液质联用分析即完成脂质标注 ×106 A PL RP+ 9. 溶血磷脂 8 (Lyso-PL) ·7 6543 2- 0 2 34 5 6 8 910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 272829 30 3132 33 343536 37 采集时间(min) ×106 ×106 9 D RP+ 8 ×106 TAG 7 2 6 1.5 54 0.5 0 .3 33.633.834.034.234.434.634.8 35.035.235.435.6 2 采集时间 (min) 0- 2 3 4 5 6 7 8 910 11 1213 14 15 16 17 18 19 20212223242526272829 303132333435 36 37 采集时间(min) 图2.来自单个肝脏组织提取物数据文件(反相色谱，正离子源)的主要标注脂类的洗脱曲线示例。A) 431种经过标注的磷脂(PL)和溶血磷脂 (lyso-PL) 的提取化合物色谱图的叠加；B)48种经过标注的神经酰胺的提取化合物色谱图的叠加； C)172种经过标注的二酰甘油 (DAG) 的提取化合物色谱图的叠加； D) 123种经过标注的三酰甘油(TAG)的提取化合物色谱图的叠加。34-36分钟窗口的放大视图说明了采用 UHPLC 法分离和标注共洗脱三酰甘油的优势，以及这类共洗脱三酰甘油的动态检测范围 与基于亲脂性(主要由碳链长度和双键数确定)的反相色谱脂质分离相比，正相色谱分离主要基于脂质头基的极性。图3表明正相色谱对于偏极性的脂质和带电脂质的分离非常高效。但会流失中性脂质(如甾醇类、 二酰甘油类和三酰甘油类)，因为使用这类流动相时中性脂质不能得到色谱保留。对于能够检测到的化合物，用户可根据已知的脂质分类特征搜索相应的目标数据库，从而提高脂质标注的准确度。例如，我们可以将搜 索范围限制在 PE脂质中，具体方法有：在限定的保留时间窗口中查询洗脱化合物；仅搜索 METLIN 脂旨 PCDL 中 PE 子集下的 PE条目或进行自定义的 SimLipid 搜索。 图3.正相色谱法分离肝脏脂质提取物时的洗脱曲线(采用正、负离子源模式)。CL：心磷脂； LPC：溶血磷脂酰胆碱； LPE：溶血磷脂酰乙醇胺；PC：磷脂酰胆碱； PE：磷脂酰乙醇胺； PG：磷脂脂甘油；PI：磷脂酰肌醇； PS：磷脂脂丝氨酸； SM：鞘磷脂 表1所示为不同数据库的搜索结果，数据 文件来自相同肝脏组织提取物在不同色谱法 和离子源条件下的分析。我们采用 MFE算法处理仅通过四极杆1获取的数据文件。所得化合物根据 METLIN 脂质 PCDL标注，也可以使用 SimLipid 软件标注。为实现高准确度的脂质标注，我们也对自动MS/MS 数据文件进行了 MFE 算法处理，但只有含MS/MS数据的化合物才能用于数据库查询。可使用 METLIN 脂质 PCDL 通MS/MS 数据的 SimLipid 软件进行标注。 过谱库匹配标注化合物，也可以使用仅基于重点注意：与 METLIN PCDL (通过可靠化学标准品获得的高质量专业谱库)标注不同， SimLipid 标注是将 MS/MS 谱图与理论模拟生成的 MS/MS碎片谱图进行匹配。以上示例表明分析人员可对色谱法进行优化 以用于不同类型脂质的分析，反相和正相液质联用系统在脂质组学分析中具有各自的选择性优势。反相液质联用系统的适用范围更加全面，能够分离多种不同类型的脂质，实现更多特征的检测和标注。另外，保留时间具有很好的重现性，有助于色谱比对和差异分析工作流程。正相液质联用系统的优势在于能够根据极性脂类的特征保留行为，对其进行更高准确度的标注。此外用户还能够迅速通过色谱图掌握样品间脂质种类的整体差异。 MFE 结果 METLIN 脂质 PCDL SimLipid 4.20 数据文件类型 特征数 标注特征数 标注特征数 反相色谱(+)仅MS 4，108 1，061 1，172 反相色谱(+)自动-MS/MS 972(612) 5 226 反相色谱(-)仅MS 1，399 586 430 反相色谱(-)自动-MS/MS 278(247) 0 65 正相色谱(+)仅MS 2.281 568 644 正相色谱(+)自动-MS/MS 774(308) 6 141 正相色谱(-)仅MS 561 309 250 正相色谱()自动-MS/MS 195(126) 1 72 ()括号仅表示具有 MS/MS 谱图的化合物，并且用于查询。 表1.来自单个肝脏脂质提取物液质联用数据文件的脂质标注结果汇总，并对以下条件进行比较：色谱方法(RP/NP)、离子化模式 (+/-)和MS数据类型(仅MS/自动 MS/MS)。数据库搜索时的质量数匹配容差为5 ppm。注：对于每种标注化合物，常常存在多个匹配脂质标注 结论 本文验证了色谱法对复杂生物样品中多种类型脂质进行全面检测和分析的能力。我们将脂质特异 UHPLC 方法与具有宽动态检测范围的精确质量Q-TOF联用，并配合使用先进的特征查找软件进行自动化脂质数据库搜索，实现了在单次液质联用分析中检测和标注出1，000余种脂质。分析人员可对色谱方法开发进行优化，以靶向分析不同类型的脂质，如我们使用两种可选的液相色谱分离方法一反相色谱和正相色谱对肝脏组织提取物进行的分离所示。从脂质组学分析的角度来看，这两种方法具有各自的选择性性势，可使脂质检测覆盖更加深入、全面。 更多信息，请访问 www.agilent.com/lifesciences/dissolution 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China 800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技公司，2015 2015年1月29日，中国印刷 5991-5494CHCN Agilent Technologies 前言脂质组学属于新兴研究领域，其核心工作是生物系统中各种脂类物质的表征和定量分析。质谱法是否能够成功检测和鉴定出给定样品中的数千种潜在脂质，将直接取决于脂质液相色谱分离的策略。肝脏、脑、心脏组织提取物是脂质组学研究中常见的生物样品。为证明色谱对脂质组学分析的影响，本应用简报以肝脏组织提取物为例，总结了使用反相 (RP) 和正相 (NP) 色谱分离不同类型脂质的优势。本研究工作采用 Agilent UHPLC 1290 系统（包括二元泵、多孔板自动进样器和柱温箱）进行。液相色谱通过安捷伦喷射流接口与 Agilent 6540 Q-TOF 联用。采用反相和正相色谱两种方法分离组织提取物。结论本文验证了色谱法对复杂生物样品中多种类型脂质进行全面检测和分析的能力。我们将脂质特异 UHPLC 方法与具有宽动态检测范围的精确质量 Q-TOF 联用，并配合使用先进的特征查找软件进行自动化脂质数据库搜索，实现了在单次液质联用分析中检测和标注出 1,000 余种脂质。分析人员可对色谱方法开发进行优化，以靶向分析不同类型的脂质，如我们使用两种可选的液相色谱分离方法 — 反相色谱和正相色谱对肝脏组织提取物进行的分离所示。从脂质组学分析的角度来看，这两种方法具有各自的选择性优势，可使脂质检测覆盖更加深入、全面。