生鲜牛乳中体细胞检测方案(培养箱)

ICS 67.050X04 NY/T 800—2004 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 800-2004 生鲜牛乳中体细胞测定方法 Enumeration of somatic cells in raw milk (ISO 133661：1997，Milk-Enumeration of somatic cells-Part 1：Microscopicmethod， ISO 13366-2：1997，Milk-Enumeration of somatic cells-Part 2：Electronic particle counter method， ISO 13366—3：1997，Milk—Enumeration ofsomatic cells-Part 3：Fluoro-opto-electronic method， MOD) 2004-04-16发布 2004-06-01实施 前 言 本标准修改采用ISO 13366-1：1997《牛奶 体细胞测定方法第一部分 显微镜法》、ISO13366—2：1997《牛奶 体细胞测定方法 第二部分 电子粒子计数法》和 ISO 13366—3：1997《牛奶体细胞测定方法第三部分荧光光电计数法》。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准起草单位：农业部乳品质量监督检验测试中心、农业部食品质量监督检验测试中心(上海)、农业部食品质量监督检验测试中心(佳木斯)和农业部食品质量监督检验测试中心(石河子)。 本标准主要起草人：王金华、张宗城、刘宁、孟序、陆静、张春林、王南云、罗小玲、程春芝。 生鲜牛乳中体细胞测定方法 范围 本标准规定了生鲜牛乳中体细胞的测定方法。 本标准适用于标准样、体细胞仪的校准以及生鲜牛乳中体细胞数的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 显微镜法 3.1 原理 将测试的生鲜牛乳涂抹在载玻片上成样膜，干燥、染色，显微镜下对细胞核可被亚甲基蓝清晰染色的细胞计数。 3.2 试剂 除非另有说明，在分析中仅使用化学纯和蒸馏水。 3.2.1 乙醇，95%。 3.2.2 四氯乙烷(C2HzCl)或三氯乙烷(C2HCl3)。 3.2.3 亚甲基蓝(C16H18ClN，S·3HO)。 3.2.4 冰醋酸(CH；COOH)。 3.2.5 硼酸(HBO3)。 3.3 仪器 3.3.1 显微镜：放大倍数×500或×1000，带刻度目镜、测微尺和机械台。 3.3.2 微量注射器：容量0.01mL。 3.3.3 载玻片：具有外槽圈定的范围，可采用血球计数板。 3.3.4 水浴锅：恒温65℃±5℃。 3.3.5 水浴锅：恒温35℃±5℃。 3.3.6 电炉：加热温度40℃±10℃。 3.3.7 砂芯漏斗：孔径≤10 pm。 3.3.8 干发型吹风机。 3.3.9 恒温箱：恒温40℃~45℃。 3.4 染色溶液制备 在250 mL 三角瓶中加入 54.0 mL乙醇(3.2.1)和40.0mL四氯乙烷(3.2.2)，摇匀；在65℃水浴锅(3.3.4)中加热3 min，取出后加入0.6g亚甲基蓝(3.2.3)，仔细混匀；降温后，置入冰箱中冷却至4℃；取出后，加入6.0mL冰醋酸(3.2.4)，混匀后用砂芯漏斗(3.3.7)过滤；装入试剂瓶，常温贮存。 3.5 试样的制备 3.5.1 采集的生鲜牛乳应保存在2℃~6℃条件下。若6h 内未测定，应加硼酸(3.2.5)防腐。硼酸在样品中的浓度不大于 0.6 g/100 mL，贮存温度2℃~6℃，贮存时间不超过24h。 3.5.2将生鲜牛乳样在35℃水浴锅(3.3.5)中加热 5 min，摇匀后冷却至室温。 3.5.3 用乙醇(3.2.1)将载玻片(3.3.3)清洗后，用无尘镜头纸擦干，火焰烤干，冷却。 3.5.4 用无尘镜头纸擦净微量注射器(3.3.2)针头后抽取0.01 mL试样(3.5.2)，用无尘镜头纸擦干微量注射器针头外残样。将试样平整地注射在有外围的载玻片(3.3.3)上，立刻置于恒温箱(3.3.9)中，水平放置5 min，形成均匀厚度样膜。在电炉(3.3.6)上烤干，将载玻片上干燥样膜浸入染色溶液(3.4)中，计时 10 min，取出后凉干。若室内湿度大，则可用干发型吹风机(3.3.8)吹干；然后，将染色的样膜浸入水中洗去剩余的染色溶液，干燥后防尘保存。 3.6 测定 3.6.1将载玻片固定在显微镜(3.3.1)的载物台上，用自然光或为增大透射光强度用电光源、聚光镜头、油浸高倍镜。 3.6.2 自单向移动机械台对逐个视野中载玻片上染色体细胞计数，明显落在视野内或在视野内显示一半以上形体的体细胞被用于计数，计数的体细胞不得少于400个。 3.7 结果计算 样品中体细胞数按式(1)计算。 式中： X——样品中体细胞数，单位为个每毫升(个/mL)； N——显微镜体细胞计数，单位为个； S—i-样膜复盖面积，单位为平方毫米(mm²)； ——单向移动机械台进行镜下计数的长度，单位为毫米(mm)； d——显微镜视野直径，单位为毫米(mm)。 3.8 允许差 相对相差≤5%。 4 电子粒子计数体细胞仪法 4.1 原理 样品中加入甲醛溶液固定体细胞，加入乳化剂电解质混合液，将包含体细胞的脂肪球加热破碎，体细胞经过狭缝，由阻抗增值产生的电压脉冲数记录，读出体细胞数。 4.2 试剂 所有试剂均为分析纯试剂，实验用水应符合 GB 6682中一级水的规格或相当纯度的水。 4.2.1 伊红Y(C20HgBraOs). 4.2.2 甲醛溶液，35%~40%。 4.2.3 乙醇，95%。 4.2.4 曲拉通X-100(Triton X-100)(C34H62Oi1)。 4.2.5 0.09 g/L氯化钠溶液：在1L水中溶入0.09g氯化钠。 4.2.6 硼酸(HBO3)。 4.3 仪器 4.3.1 砂芯漏斗，孔径≤0.5 um。 4.3.2 电子粒子计数体细胞仪。 4.3.3 水浴锅：恒温40℃±1℃。 4.4 固定液制备 4.4.1 在100 mL容量瓶中加入0.02g伊红Y(4.2.1)和9.40 mL甲醛(4.2.2)，用水溶解后定容。混匀后，用砂芯漏斗(4.3.1)过滤，滤液装入试剂瓶，常温保存。 4.4.2可使用电子粒子计数体细胞仪生产厂提供的固定液。 4.5 乳化剂电解质混合液制备 4.5.1 在1L烧杯中加入125 mL乙醇(4.2.3)和20.0mL曲拉通X立100(4.2.4)，仔细混匀；加入885mL氯化钠溶液(4.2.5)，混匀后，用砂芯漏斗(4.3.1)过滤；滤液装入试剂瓶，常温保存。 4.5.2或使用电子粒子计数体细胞仪专用的乳化化电解质混合液。 4.6 试样的制备 4.6.1 采集的生鲜牛乳应保存在2℃~6℃条件下。若6h内未测定，应加硼酸(4.2.6)防腐，硼酸在样品中的浓度不大于0.6 g/100 mL，贮存温度2℃~6℃，贮存时间不超过 24 h。 4.6.2采样后应立即固定体细胞，即在混匀的样品中吸取 10 mL 样品，加入0.2 mL 固定液(4.4)，可在采样前在采样管内预先加入以上比例的固定液(4.4)，但采样管应密封，以防甲醛挥发。 4.7 测定 将试样(4.6)置于水浴锅(4.3.3)中加热 5 min，取出后颠倒9次，再水平振摇5次~8次，然后在不低于30℃条件下置入电子粒子计数体细胞仪测定。 4.8 结果 直接读数，单位为千个每毫升。 4.9 允许差 相对相差≤15%。 4.10 校正 4.10.1 在以下情况之一应进行校正： 连续进行2个月； 经长期停用，开始使用时； c) 体细胞仪维修后开始使用时。 4.10.2校正使用专用标样，连续测定5次，取出平均值。 4.10.3 标样中体细胞含量为每毫升40万个~50万个，测定平均值与标样指标值的相对误差应为≤10%。 4.11 稳定性试验 4.11.1 在1个工作日内对体细胞含量为每毫升50万个左右的样品，以每50个样作规律性的间隔计数。 4.11.2在1个工作日结束时，按式(2)计算变异系数。 式中： CV——变异系数，单位为百分率(%)； S ——数次测定的标准差，单位为个每毫升(个/mL)； 11 数次测定的平均值，单位为个每毫升(个/mL)。 4.11.3 变异系数应≤5%。 5 荧光光电计数体细胞仪法 5.1 原理 样品在荧光光电计数体细胞仪中与染色一缓冲溶液混合后，由显微镜感应细胞核内脱氧核糖核酸染色后产生荧光的染色细胞，转化为电脉冲，经放大记录，直接显示读数。 5.2试剂 所有试剂均为分析纯试剂，实验用水应符合 GB 6682 中一级水的规格或相当纯度的水。 5.2.1 溴化乙锭(CH20BrN3)。 5.2.2 柠檬酸三钾(CH5OK3·HzO)。 5.2.3 柠檬酸(C，HgO·HzO)。 5.2.4 曲拉通X-100(Triton X-100)(C34H62O11)。 5.2.5氢氧化铵溶液，25%。 5.2.6 硼酸(H，BO). 5.2.7 重铬酸钾(K2CrzO)。 5.2.8 叠氮化钠(NaN3)。 5.3 仪器 5.3.1 荧光光电计数体细胞仪。 5.3.2 水浴锅：恒温40℃±1℃。 5.4 染色一缓冲溶液制备 5.4.1 染色一缓冲储备液 在5L试剂瓶中加入1L水，在其中溶入2.5g溴化乙锭(5.2.1)，搅拌，可加热到40℃~60℃，加速溶解；使其完全溶解后，加入400 g柠檬酸三钾(5.2.2)和14.5g柠檬酸(5.2.3)，再加入4L水，搅拌，使其完全溶解；然后，边搅拌边加入50 g曲拉通X100(5.2.4)，混匀，贮存在避光、密封和阴凉的环境中，90d内有效。 5.4.2染色一缓冲工作液 将1份体积染色一缓冲储备液(5.4.1)与9份体积水混合，7d内有效。 5.4.3 或使用荧光光电计数体细胞仪专用的染色一缓冲工作液。 5.5 清洗液制备 5.5.1 将10g曲拉通X一100(5.2.4)和25 mL 氢氧化铵溶液(5.2.5)溶入10L水，仔细搅拌，完全溶解后贮存在密封、阴凉的环境中，25d内有效。 5.5.2 或使用荧光光电计数体细胞仪专用清洗液。 5.6 试样的防腐 5.6.1 采样管内生鲜牛乳中加入荧光光电计数体细胞仪仪用防腐剂，溶解后充分摇匀 5.6.2 如无以上防腐剂，则在生鲜牛乳采样后加入以下1种防腐剂(24h内)： 硼酸(5.2.6)：在样品中浓度不超过0.6 g/100 mL，在6℃~12℃条件下可保存24h； 重铬酸钾(5.2.7)：在样品中浓度不超过 0.2g/100 mL，在6℃~12℃条件下可保存72 h。 5.7 测定 将试样(5.6)置于水浴锅(5.3.2)中加热 5 min，取出后颠倒9次，再水平振摇5次~8次，然后在不低于30℃条件下置入仪器测定。 5.8 结果 直接读数，单位为千个每毫升。 5.9 允许差 相对相差≤15%。 5.10 校正 5.10.1在以下情况之一应进行校交： 连续进行2个月； 经长期停用，开始使用时； 体细胞仪维修后开始使用时。 5.10.2校正使用专用标样，连续测定5次，得出平均值。 5.10.3标样中体细胞含量为每毫升40万个~50万个，测定平均值与标样指标值的相对误差应≤10%。 5.11 稳定性试验 5.11.1在1个工作日内对体细胞含量为每毫升50万个左右的样品，以每50个样作规律性的间隔计数。 5.11.2在1个工作日结束时，按式(3)计算变异系数。 式中： CV——变异系数，单位为百分率(%)； -数次测定的标准差，单位为个每毫升(个/mL)； n——数次测定的平均值，单位为个每毫升(个/mL)。 5.11.3 变异系数应≤5%。 中华人民共和国农业部发布 用恒温培养箱进行生鲜牛乳中体细胞的测定1.原理    将测试的生鲜牛乳涂抹在载玻片上成样膜，干燥、染色，显微镜下对细胞核可被亚甲基蓝清晰染色的细胞计数。2.试剂    除非另有说明，在分析中仅使用化学纯和蒸馏水。2.1乙醇，95%。2.2四氯乙烷(Cz Hz Cl 4) 或三氯乙烷(C zHy Cl 3) 。2.3亚甲基蓝(Ci6HisCIN3S·3H2O) 。2.4冰醋酸(CH3COOH) 。2.5硼酸(H3BO3)。3.仪器3.1显微镜：放大倍数x500或×1000，带刻度目镜、测微尺和机械台。3.2微量注射器：容量0.01mLc3.3载玻片：具有外槽圈定的范围，可采用血球计数板。3.4水浴锅：恒温65℃±5℃。3.5水浴锅：恒温35℃±5℃。3.6电炉：加热温度40℃±10℃。3.7砂芯漏斗：孔径≤10pm。3.8干发型吹风机。3.9恒温培养箱：恒温40℃~45℃。4.染色溶液制备    在250mL三角瓶中加人54.0mL乙醇和40.0mL四氯乙烷，摇匀；在65℃水浴锅中加热3min， 取出后加入0.6g亚甲基蓝， 仔细混匀； 降温后， 置人冰箱中冷却至4℃；取出后，加入6.0mL冰醋酸，混匀后用砂芯漏斗过滤；装人试剂瓶，常温贮存。4.1采集的生鲜牛乳应保存在2℃~6℃条件下。若6h内未测定，应加硼酸防腐。硼酸在样品中的浓度不大于0.6g/100mL，贮存温度2℃~6℃，贮存时间不超过24h。4.2将生鲜牛乳样在35℃水浴锅 中加热5min， 摇匀后冷却至室温。4.3用乙醇将载玻片清洗后，用无尘镜头纸擦干，火焰烤干，冷却。4.4用无尘镜头纸擦净微量注射器针头后抽取0.01mL试样，用无尘镜头纸擦干微量注射器针头外残样。将试样平整地注射在有外围的载玻片上，立刻置于恒温培养箱中，水平放置5mmin， 形成均匀厚度样膜。在电炉 上烤干， 将载玻片上干燥样膜浸入染色溶液 中，计时10min， 取出后凉干。若室内湿度大， 则可用干发型吹风机吹干； 然后， 将染色的样膜浸入水中洗去剩余的染色溶液，干燥后防尘保存。5.测定5.1将载玻片固定在显微镜的载物台上，用自然光或为增大透射光强度用电光源、聚光镜头、油浸高倍镜。5.2单向移动机械台对逐个视野中载玻片上染色体细胞计数，明显落在视野内或在视野内显示一半以上形体的体细胞被用于计数，计数的体细胞不得少于400个。