食品（饮料）中邻苯二甲酸酯类化合物检测方案(毛细管柱)

采用快速、灵敏和耐用的 GC/MS 或LC/MS方法检测食品中的邻苯二甲酸酯类化合物 应用报告 食品安全 作者 摘要 Jimmy Chan 台湾安捷伦科技有限公司 台北104 台湾 近期发生的一系列国际食品安全危机事件，使人们更加关注适合广泛质谱平台、能够灵敏可靠地分析食品中污染物方法的快速开发。最近的例子就是在台湾出现的果汁饮料和其他食品中非法添加邻苯二甲酸酯类化合物事件。安捷伦公司业已开发出在 GC/MS 和LC/MS上运行的高灵敏度定量分析方法，用于检测食品中的邻苯二甲酸酯类化合物。 冯爽 安捷伦科技有限公司(中国) 广州510613 中国 Agilent Technologies 引言 邻苯二甲酸的酯类化合物称为邻苯二甲酸酯，常用做增塑剂以提高塑料及其制品的柔韧性、透明度、耐用性和使用寿命。邻苯二甲酸酯类化合物用途广泛，可以作为药丸的肠溶衣材料，也可以用于乳剂和混悬剂的制备。我们可以在许多产品中发现它的身影，比如粘合剂和胶水、电子器件、1个人护理产品、医疗设备、管材、包装材料和儿童玩具等。由于这些化合物并非与塑料共价结合而只是混合，所以它们很容易释放到环境中去。研究表明，邻苯二甲酸酯类化合物可以引起许多健康问题，包括哮喘、内分泌紊乱、生殖功能异常、癌症、低出生体重、自闭症和注意力缺陷多动症(ADHD)等。因此，欧盟(EU)、美国 (USA)， 以及其他一些国家已经开始监管邻苯二甲酸酯类化合物的暴露问题。从2007年开始，欧盟 (2005/84/EC)即对六种邻苯二甲酸酯类化合物在儿童玩具中的使用进行了严格控制，而美国从2009年起也开始执行类似法规(表1)。 2011年5月，作为起云剂(乳化剂)的替代品，邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)被发现非法添加到运动饮料、果汁、茶饮料、果酱和食品粉等产品中。起云剂能改善果汁等产品的外观。该事件中邻苯二甲酸酯类化合物被用作棕榈油的替代品。这些非法产品马上被召回，并且由于它们可能出口，当局随即又发布了一个全球通告。在中国大陆和台湾地区，任何一种邻苯二甲酸酯类化合物在食品中的最大允许量是 1ppm。 为了保护消费者不受这种不道德加工产品的伤害，建立可以快速检测食品中邻苯二甲酸酯类化合物的灵敏、可靠的分析方法非常必要。本应用报告描述了可灵敏检测包括当前美国和欧盟管控的六种该类化合物在内的邻苯二甲酸酯类化合物的方法，可于GC/MS和LC/MS平台上运行，使用单四极杆和三重四极杆质谱。GC/MS 方法可以检测少至 50ppb 的邻苯二甲酸酯类化合物，而LC/MS方法采用三重四极杆质谱时，灵敏度更高，可检测 1ppb水平的该类化合物。两者的检测水平已足够确保上市食品中不含有超过美国、欧盟、中国大陆和台湾地区规定限量的邻苯二甲酸酯类化合物。 表 1. 最常见的邻苯二甲酸酯类化合物 化合物名称 首字母缩写词 邻苯二甲酸二正己酯 DNHP 用黑体和斜体标明的六种邻苯二甲酸酯类化合物系美国和欧盟管控品种 试剂与标准品 GC标准品：邻苯二甲酸二丁酯 (DBP， CAS 84-74-2)、邻苯二甲酸丁苄酯 (BBP， CAS 85-68-7)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP， CAS 117-81-7)、邻苯二甲酸二正辛酯 (DNOP， CAS117-84-0)、邻苯二甲酸二异癸酯 (DIDP， 26761-40-0)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP， 28553-12-0)购自 ChemService 公司 (WestChester， PA， 美国)。这些标准品溶于二氯甲烷中。 LC标准品：30种邻苯二甲酸酯标准品均购自 Dr. EhrentorferGmbH 公司。单个邻苯二甲酸酯类化合物的贮备液配制为浓度为100-1000 ug/mL的甲醇溶液。制备校准曲线用的工作标准溶液系采用甲醇稀释贮备液配制，每个邻苯二甲酸酯类化合物浓度为10 pg/mL. 仪器 ( GC/MS 和 GC/MS/MS 实验于配备了 Agilent 5975C GC/MSD或 7000B三重四极杆 GC/MS 的 Agilent 7890A GC 系统上运行。 LC/MS 和 LC/MS/MS 实验于配备了 Agilent 6140单四极杆LC/MS或 Agilent 6400 系列三重四极杆 LC/MS 的 Agilent 1260RRLC HPLC 系统上运行。仪器条件见表 2-4。 ) 表2. GC/MS 和 GC/MS/MS条件 GC 运行条件 色谱柱 Agilent J&W DB-5MS Ultra Inert Capillary GC column， 30 m×0.25 mm， 0.25 pm (部件号122-5532UI) 进样体积 1pL 进样口温度 290℃， 恒温 进样模式 不分流 柱温程序 120℃保持1mim， 以20°C/min 的速度上升到300°C， 保持5min 后运行 300°℃ 保持 5 min 载气 氦气， 1.2 mL/min 传输线温度 300°℃ Agilent 5975C 系列 GC/MSD (单四极杆)条件 扫描模式 El， SIM/Scan 采集参数 质量范围50-500amu Agilent 7000B 三重四极杆 GC/MS条件 模式 El， MRM 源温度 230°C 四极杆温度 Q1 和 02=150℃ 调谐文件 atunes.eiextune.xml 碰撞气流速 氮气 1.5mL/min， 氦气 2.25mL/min 检测器增益 15 表 3. 分离30种邻苯二甲酸酯类化合物的 LC/MS 条件 表4. 分离13种邻苯二甲酸酯类化合物的LC/MS/MS 条件 LC 运行条件 LC 运行条件 色谱柱 分析： Agilent ZORBAX Eclipse Plus， 2.1 × 50 mm， 1.8um (部件牛959741-912) 柱温 25°C 进样体积 10 pL 流动相 A=重蒸水 B=甲醇 运行时间 6.0 min 流速 0.5 mL/min 梯度表 时间 (min) 0 2.0 5.0 5.5 5.51 B% 60.0 80.0 100.0 100.0 60.0 Agilent 6410 MSD (单四极杆) LC/MS 系统条件 色谱柱 Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18， 2.1 × 100 mm， 1.8 um (部件号959758-902) 柱温 50 °C 进样体积 10 pL 自动进样器温度 6°C 流动相 A=重蒸水 B=甲醇+5.0mM 甲酸铵溶液 运行时间 10 min 流速 0.55 mL/min 梯度表 1260 RRLC 时间 (min) 0 5.0 6.0 8.1 8 流速(mL/min) 0.2 0.55 0.55 0.55 0.55 B% 90.0 90.0 95.0 100.0 95.0 Agilent 1290 Infinity GC 系统 时间 (min) 0 5.0 8 8.1 流速(mL/min) 0.2 0.55 0.55 0.55 B% 90.0 90.0 90.0 100.0 Agilent 6400 系列三重四极杆 LC/MS/MS 条件 离子模式 ESI， 正离子模式 干燥气温度 350°C 干燥气流速 10 L/min 雾化器压力 40 psi 毛细管电压 4000 V MRM数据采集 分段 MRM (区段1为0-3.5 min；区段2为 3.5-8.0 min) 样品制备 GC/MS 三个饮用水样品由台湾食品工业发展研究所提供。用于检验样品制备方法可行性的红茶、运动饮料、橙汁和拿铁咖啡等四种饮料购自零售店。采用固相萃取 (SPE) 法代替传统的己烷液液萃取法处理样品，可以减少背景干扰，并加快提取过程。于玻璃套管中加入 5 g Agilent Chem Elut材料(部件号198003)，然后加载5mL水性样品，并使之完全浸入 Chem Elut 吸附剂中。吸附剂用二氯甲烷淋洗三次，每次5mL， 洗脱出分析物并留下污染物。分析前用用气将样品吹至2.5 mL. LC/MS 取饮料、食品粉、健康护理产品或烤制食品各1g，用 45mL甲醇提取，超声 20 min。样品提取液放冷至室温(约25-30C)后，用甲醇定容到 50mL量瓶中。分析前，将1mL提取液离心(3500 rpm) 10 min。 分析参数 采用的 MS 和 MS/MS 参数见表 5-8。 编号 化合物 CAS号 目标离子 01 02 03 DBP 84-74-2 149 150 223 205 BBP 85-68-7 149 91 206 238 DEHP 117-81-7 149 167 279 104 DNOP 117-84-0 279 149 167 261 5 DINP 28553-12-0 293 149 127 167 6 DIDP 26761-40-0 307 149 141 167 表6. Agilent 7000B 三重四极杆 GC/MS分析参数 编号 化合物 定量离子对 定性离子对 DBP 149→65@ 30 eV 149→93@ 20 eV 223→149@ 10eV 2 BBP 149→65@ 30 eV 149-93@ 20 eV 206→149@ 10 eV 3 DEHP 149-65@ 30 eV 149→93@20 eV 279-149@ 15 eV 4 DNOP 279→71@ 10 eV 279-149@ 15 eV 5 DINP 293→71@10 eV 293→149@ 10 eV 6 DIDP 307-71@ 10 eV 307-149@ 10 eV 表7. 采用 Agilent 6140单四极杆 LC/MS系统分离30 种邻苯二甲酸酯类化合物的分析参数 表8. 采用 Agilent 6400 三重四极杆 LC/MS系统分离13种邻苯二甲酸酯类化合物的分析参数 447.3→71 25 结果与讨论 样品制备 该 GC 和 LC方法运用成功的关键之一就是要求样品制备技术快速并且能够减少背景噪音。实验室中，其它来源的邻苯二甲酸酯类化合物污染有许多，比如来自塑料管和容器。谨慎仔细的样品制备对于获得没有污染和化学干扰产生的背景噪音的结果非常关键。GC分析食品中邻苯二甲酸酯类化合物的一个传统样品处理方法， 按照中国大陆标准 GB21911-2008规定，系采用己烷进行液液萃 取。而采用 Agilent Chem Elut 固相萃取小柱代替上述传统方法制备样品更简便快速，整个操作不超过 10 min， 并且消耗更少，邻苯二甲酸酯类化合物污染机会也更小。图1对比了采用 ChemElut 固相萃取及传统液液萃取制备样品的分析状况，显然前者背景噪音低，无污染。 在LC/MS分析中， 台湾 FDA 建立了一种甲醇提取并超声 20min的全新方法，用于饮料、食品粉、健康护理产品和烤制食品的样品提取。样品制备前加入了一个内标，保证方法定量分析的准确性。 定量分析的灵敏度和线性 GC/MS 和 GC/MS/MS 方法检测标准溶液的灵敏度已轻松超过了中国大陆 (GB21911-2008) 和台湾地区对邻苯二甲酸酯类化合物的限量规定，即食品中任何该类化合物的含量不得超过 1 ppm。不管使用单四极杆 (MSD) 还是三重四极杆质谱平台，检测灵敏度均在 50-100ppb 范围内，定量的线性相关系数(R2)大于等于0.992(见图2和3)。 响应 化合物 线性范围(mg/L) 相关系数(R2) DBP 0.05-1 0.998 2BBP 0.05-1 0.996 3DEHP 0.05-1 0.992 4DNOP 0.05-1 0.992 5DINP 0.1-2 0.997 DIDP 0.1-2 0.996 化合物 1DBP 0.05-1 0.998 2 BBP 0.05-1 0.998 3DEHP 0.05-1 0.998 4 DNOP 0.05-1 0.997 5 DINP 0.1-2 0.999 6DIDP 0.1-2 0.998 图3 种最严关注的邻茶二甲酸酯类化合物的校准曲线、线性范围和相关系数，采用 Agilent 7000B 三重四极杆 GC/MS 系统， MRM 模式分析 如图4所示， 采用 GC/MSD 平台分析，其重现性也非常理想。Agilent 5975 GC/MS 的一个最大特点就是可以同步获取 SIM和 Scan 分析数据，如图5所分分析15种邻苯二甲酸酯类化合物的情况。这种特点降低了出现假阳性的可能性。 图4. 六种管控的邻苯二甲酸酯类化合物以 0.05 mg/L (50 ppb) 六次进样分析得到的总离子流(TIC)色谱图的重现性。所有六次运行结果几乎是重合的 图5. 15种邻苯二甲酸酯类化合物混合物的同步 GC/MS Scan 和 SIM分析 采用LC/MS法同时分析30种邻苯二甲酸酯类化合物的甲醇溶液，得到的仪器检测限范围是50-500 ppb。 LC/MS/MS 法提供的仪器检测限(IDL)远低于台湾 FDA 20 ppb 的限量要求，分析13种邻苯二甲酸酯类化合物的数据见表9 (ug/mL=ppb)， 定量的线性相关系数R²远大于或等于 0.9947(萃取离子流色谱图见图6)。同时采用 C18色谱柱，建立了分离14种邻苯二甲酸酯类化合物的同分异构体，尤其是 DIBP 和 DBP 的LC/MS/MS方法(数据未列出). 表9. 采用 LC/MS/MS方法分析13种邻苯二甲酸酯类化合物的仪器检测限 化合物 R2 DMP 0.9955 2 DEP 0.9968 3 DAP 0.9947 0.3 DPP 0.9983 0.5 DBP 0.9949 5 BBP 0.9962 0.5 DCP 0.9981 0.3 DNHP 0.9981 0.5 DEHP 0.9949 5 DEHA 0.9972 0.5 DNOP 0.9979 0.5 DINP 0.9993 5 DIDP 0.9998 5 响应 vs 采集时间(min) 图6. 采用 LC/MS/MS方法分离13种邻苯二甲酸酯类化合物的萃取离子流 (EIC) 色谱图 样品检验结果 采用本文建立的 GC 方法分析了购自零售店的三种饮料样品。GC/MS 分析结果见表10。样品 SN1874 中的 DINP 和样品SA2549 中的 DEHP、DINP 和 DNOP 含量超过了中国大陆和台湾地区区定的限量标准(1ppm)。实际上，样品2549 中 DINP的含量甚至超过了规定限量100倍。 同时也对运动饮料中可能存在的几种邻苯二甲酸酯类化合物进行了 LC/MS/MS 分析。通过往一个运动饮料样品中添加适量DEHP 后， 再同法进行样品制备，建立了一条基质校准曲线(图7)。这条校准曲线用于定量分析另一个运动饮料样品中的DEHP。两种定性离子的丰度比分别是1.7和2.0， 与鉴别 DEHP标准品的数据吻合。该运动饮料中检测到的 DEHP 浓度是1.05 ppm， 恰高于台湾 FDA 规定的 1ppm 限量。 表 10. 三种饮料样品的 GC/MS分析结果 DEHP DINP DNOP (mg/L) (mg/L) (mg/L) SN610 ND ND ND SN1874 ND 2.13 ND SA2549 72.5 137 19.0 ND=未检测到 Batch Table Sample：GX249 Sample Type： Compound：DEHP ISTD： 回围Re Compound Group：： Sample Group： ISTD： Time Segment： Sample DEHP Me DEHP Results Qualif. Qualif_ Name Data File Type Level Acq. Date-Time Dil Exp. Conc. RT Resp. Calc. Conc. Final Conc. Accuracy S/N Ratio Ratio STD-5 STD-5.d Cal 1 6/6/2011 1203PM 1.0 5.0000 3.804 31040 4.5308 4.5308 90.6 384.82 1.8 23 STD-10 STD-10.d Cal 2 6/6/2011 12：17PM 1.0 10.0000 3.755 49943 10.2668 10.2668 102.7 917.12 1.8 23 STD-20 STD-20.d Cal 3 6/6/2011 12：31 PM 1.0 20.0000 3.765 86308 21.3024 21.3024 106.5 Infinity 1.8 23 STD-50 STD-50.d Cal 4 6/6/2011 12：44 PM 1.0 50.0000 3.765 185174 51.3043 51.3043 102.6 Intinity 1.8 23 STD-100 STD-100.d Cal 5 6/6/2011 1258 PM 1.0 100.0000 3.746 337719 97.5957 97.5957 97.6 10292.63 1.7 2.1 0 GX249 GX249.d Sample 6/9/2011 7：42 AM 50.0 3.669 84769| 20.8354 1041.7714 1067.15 1.7 2.0 Compound Information Calibration Curve × 结论 安捷伦公司已经建立了快速检测和定量分析食品中邻苯二甲酸酯类化合物的方法，无论您的实验室拥有怎样的质谱平台，对这30种邻苯二甲酸酯类化合物有怎样的定性要求，以及对欧盟和美国重点管控的六种低含量水平的该类化合物的准确定量要求如何，该方法均可满足众多实验室的需要。 Agilent GC/MS 和 LC/MS系统具有的灵活性和优异性能，可以确保对突发食品安全危机事件做出快速响应。 更多信息 这些数据代表了典型的结果。如需了解更多有关我们产品和服务的信息，请访问我们的网站 www.agilent.com/chem/cn。 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明及技术规格等如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2011 2011年12月8日，中国印刷 5990-9510CHCN Agilent Technologies 邻苯二甲酸的酯类化合物称为邻苯二甲酸酯，常用做增塑剂以提高塑料及其制品的柔韧性、透明度、耐用性和使用寿命。邻苯二甲酸酯类化合物用途广泛，可以作为药丸的肠溶衣材料，也可以用于乳剂和混悬剂的制备。我们可以在许多产品中发现它的身影，比如粘合剂和胶水、电子器件、个人护理产品、医疗设备、管材、包装材料和儿童玩具等。由于这些化合物并非与塑料共价结合而只是混合，所以它们很容易释放到环境中去。研究表明，邻苯二甲酸酯类化合物可以引起许多健康问题，包括哮喘、内分泌紊乱、生殖功能异常、癌症、低出生体重、自闭症和注意力缺陷多动症(ADHD) 等。因此，欧盟(EU)、美国(USA)，以及其他一些国家已经开始监管邻苯二甲酸酯类化合物的暴露问题。从2007 年开始，欧盟(2005/84/EC) 即对六种邻苯二甲酸酯类化合物在儿童玩具中的使用进行了严格控制，而美国从2009年起也开始执行类似法规（表1）。