高效液相色谱法+咖啡和红酒+赭曲霉毒素A

咖啡和红酒中赭曲霉毒素A解决方案

前言

赭曲霉毒素A：

赭曲霉毒素是曲霉菌属和青霉菌属的某些菌株产生的二级代谢产品，包含7种结构类似的化合物。赭曲霉毒素的污染在全球范围内都比较严重，其中赭曲霉毒素A在自然界分布最广，毒性最强，对人类和动植物影响最大。赭曲霉毒素A具有很强的肝脏毒性和肾脏毒性，并有致畸、致突变和致癌作用。动物实验表明摄入了被这种毒素污染的饲料后，会发生急性或慢性中毒症。

赭曲霉毒素A广泛分布于自然界，粮谷类、咖啡、茶叶等多种农作物和食品均可被赭曲霉毒素A污染。在欧洲食品中赭曲霉毒素A风险评估报告曾指出，人类摄入赭曲霉毒素A主要来自谷物，其次是葡萄酒和咖啡等。防止污染赭曲霉毒素A的食品和饲料直接或间接地进入人类食物链，加强对赭曲霉毒素A的监测十分重要。

国家标准

咖啡和红酒中赭曲霉毒素A的限量标准

用于酿酒的农产品（例如葡萄）在生长、储存和加工过程中易感染真菌，进而受到真菌毒素的污染。赭曲霉毒素A是葡萄酒中最常见的一种真菌毒素。

目前，世界上有40多个国家规定了粮食及其制品、果酒、干果及婴幼儿食品中赭曲霉毒素A的限量，但仅有古巴、新加坡和意大利等国家制定了咖啡中赭曲霉毒素A的限量标准（限量值在2.5-50 μg/kg），台湾2012年9月修订发布的咖啡中赭曲霉毒素A的限量标准值为5 μg/kg。另外，2005年欧盟规定葡萄酒、以及用于饮料制作的葡萄酒或者葡萄， 限量为2.0 μg/kg；葡萄汁和其他饮料中的葡萄汁成分中为2.0 μg/kg。国际葡萄与葡萄酒组织将葡萄酒中OTA的限量标准定为2.0 μg/kg。

咖啡和红酒是现代社会深受人们喜爱的饮品和酒类，如果长期饮用受赭曲霉毒素A污染的咖啡或红酒，会对人体的健康产生一定的危害。结合我国葡萄酒和咖啡中赭曲霉毒素A污染及产品消费量情况，卫计委组织相关评估小组对对我国葡萄酒和咖啡中赭曲霉毒素A的暴露风险进行了评估。

根据风险评估结果，2017年9月17日施行的GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》，新增了葡萄酒和咖啡中赭曲霉毒素A限量。葡萄酒中赭曲霉毒素A限量标准为2.0 μg/kg；咖啡豆和咖啡粉中赭曲霉毒素A限量标准为5.0 μg/kg，速溶咖啡中赭曲霉毒素A限量标准为10.0 μg/kg。

赭曲霉毒素A的检测方法

食品中赭曲霉毒素A的检测，有两个标准方法：GB5009.96-2016《食品中赭曲霉毒素检测》和SNT4675.10-2016《出口葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定液相色谱-质谱/质谱法》。二种方法均需要使用免疫亲和柱或净化柱对样品进行纯化，再用仪器进行检测。青岛普瑞邦生物工程有限公司专门研发了针对咖啡和红酒复杂基质的专用免疫亲和柱。

该产品原理是抗原抗体反应，赭曲霉毒素A抗体固定于柱内凝胶上，样品中的赭曲霉毒素A经过提取，过滤，稀释，然后将样品提取液缓慢的通过赭曲霉毒素A免疫亲和层析柱，在柱内赭曲霉毒素A与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱，除去未结合的其他物质。用乙酸甲醇洗脱赭曲霉毒素A，注入到分析仪器中进行检测。

实验过程

1. 咖啡中赭曲霉毒素A的检测

1.1. 样品处理:

1.1.1. 咖啡

1.1.1.1. 取5 g研磨好的咖啡粉末于锥形瓶中，加入50 mL三氯甲烷并混合均匀，震荡30 min后，4000r/min离心5 min，过玻璃纤维滤纸。

1.1.1.2. 移取20 mL滤液至离心管中加入10mL30g/L的碳酸氢钠溶液震荡2min后静置10min，5000r/min离心10min。

1.1.1.3. 取上清液5mL，加入15mL专用淋洗液后混合均匀，待过免疫亲和柱。

1.1.2. 红酒

1.1.2.1. 称取1g混合均匀的红酒样品于25mL容量瓶中，加入专用淋洗液定容至25mL，超声提取5min。

1.1.2.2. 5000r/min离心10min，过玻璃纤维滤纸，移取全部提取液过柱。

1.2. 操作程序：

1.2.1. 连接:将低温下的免疫亲和柱恢复至室温。将泵流操作架的注射器下端用力插穿免疫亲和柱上盖中间圆孔，使其连通；

1.2.2. 上样:移取上述提取液移至注射器内，打开下端堵头；

1.2.3. 富集:将空气压力泵与注射器连接，调节压力使样品提取液缓慢通过免疫亲和柱，控制样液以1mL/min~3mL/min的速度稳定下滴。；

1.2.4. 洗涤:分别用5mL 专用淋洗液和5mL水进行淋洗，并使2~3mL空气通过柱体；

1.2.5. 洗脱: 为保证洗脱充分，建议以2.0mL2%乙酸甲醇分两步进行洗脱，重力洗脱即可。首先，将免疫亲和柱内液体排干，加1.0mL2%乙酸甲醇于柱管内，重力过柱，当溶剂通过柱子后；再加入1.0mL2%乙酸甲醇重复上述洗脱步骤，最后轻微加压排净洗脱液，合并洗脱液于2ml容量瓶中，用2%乙酸甲醇定容后，0.22μm滤膜过滤，待测。

1.3. 色谱条件

高效液相色谱参考条件列出如下：

a) 色谱柱：C₁₈柱，柱长150mm,内径4.6mm,粒径5μm；

b) 流动相：乙腈-水-冰乙酸（96+102+2）；

c) 流速：1.0mL/min;

d) 柱温：35℃；

e) 进样量：50μL；

f) 检测波长：激发波长333nm，发射波长460nm。

1.4. 咖啡加标检测结果分析：

检测结果显示：加标回收范围在81.36%~85.68%，相对标准偏差为2.27%。回收效果良好。

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