超高效液相色谱-串联质谱+粮谷+11种真菌毒素

粮谷中11种真菌毒素检测解决方案

摘要：

建立粮谷中多种真菌毒素的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品用乙腈-水溶液提取，经固相净化柱PriboFast^®100进行净化，采用 C¹⁸色谱柱进行分离，以20mmol/L乙酸铵溶液和乙腈梯度洗脱，利用超高效液相色谱-串联质谱进行分析。11种真菌毒素在测定浓度范围内线性关系良好，各组分相关系数 R² >0.998，加标回收率范围72.4%～90.7%，方法精密度范围6.2%～11.8%，测定各组分真菌毒素定量限范围1.2μg/kg～2.0μg/kg。该方法前处理过程便捷、灵敏度高、重现性好，适用于粮谷中11种真菌毒素的测定。

关键词：

固相净化柱；多毒素；真菌毒素；超高效液相色谱-串联质谱

前言：

真菌毒素是由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，是各种粮食及农副产品的主要污染物之一，据联合国粮农组织（FAO）报道世界上约有25%的农作物受到真菌毒素的污染。真菌毒素具有致癌及极强的细胞毒性，极易威胁到人体的健康。例如，黄曲霉毒素即使摄入很小剂量也会引起肝脏的损害、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生；单端孢霉烯族B类毒素能够导致厌食、呕吐、贫血、出血以及免疫抑制的症状；赭曲霉毒素具有致癌作用、致畸作用、肾毒性等。因此，世界各国对食品中的真菌毒素的限量均做了规定。

我国2011年颁布了最新的《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB/T 2761-2011），相比GB/T 2761-2005增加了赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的指标；修改了黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素M₁、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及展青霉素限量指标及检测方法，而2017年又补充了样品种类。可见我国对真菌毒素在食品中的限量要求越来越高，限制的食品种类也越来越细。欧盟于2006年颁布了《Regulation (EC) No 1881/2006》，对食品中污染物的限量进行规定，2012年又颁布了《Regulation (EC) No 594/2012》，对《Regulation (EC) No 1881/2006》进行了修订，对干果等食品中的赭曲霉毒素A的最高限量作了规定。相对于其他国家来讲，日本的要求最为严格，要求在食品中不得检出黄曲霉毒素。

目前对于真菌毒素的检测主要方法有酶联免疫法，气相色谱法，高效液相色谱法，液相色谱-串联质谱法。酶联免疫法虽然设备要求简单，但是准确度上无法保证，大批量检测时容易出现假阳性结果；气相色谱法由于对分析物质要求具有低沸点且热稳定性好，所以在多组分真菌毒素的分析上应用受到了限制；高效液相色谱法稳定性较好，但是单一通过保留时间定性很难应用于多组分的真菌毒素的测定； 高效液相色谱-串联质谱法能够克服上诉方法的缺点，具有高分离度、高准确度的特点。因此建立以乙腈-水溶液为提取液、固相净化柱净化、超高效液相色谱-串联质谱同时检测食品中多种真菌毒素的方法。

材料与方法

1.1 主要仪器

TSQ Quantum 三重四极杆串联谱仪戴安U3000 超高效液相色谱仪

固相净化柱（型号 PriboSpin^TM 100，2 mL）：Pribolab 公司

离心机

超声水浴锅

Pribolab超纯水机：

1.2 标准品及配置 

黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、伏马菌素B₁、伏马菌素B₂、伏马菌素B₃、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇：Pribolab（青岛普瑞邦）公司。将上述标准溶液用乙腈配置为10μg/mL的混合标准储备液，使用时用流动相初始比例配置标准曲线。

1.3 样品前处理

称取粉碎并混合均匀后的样品5.0g于50mL离心管，加入提取液（乙腈∶水=60∶40，体积比）20mL，超声辅助提取30min，于10000r/min离心5min，取上清液8 mL过多功能柱净化，准确移取净化后的样液2mL于40℃下氮气吹干，使用流动相初始比例定容至1mL，过0.45μm微孔滤膜，用UPLC-MS/MS测定。

1.4 超高效液相色谱及质谱条件

1.4.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：XTerra MS C18色谱柱；进样量：10μL；流动相：A为20 mmol/L乙酸铵，B为乙腈；流速：0.3mL/min；柱温：30℃。梯度进样程序见表1。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI±模式同时扫描）；多反应监测MRM模式；喷雾电压正离子模式3500V，负离子模式3000V；离子源温度280℃；脱溶剂温度300 ℃；鞘气（N₂）40arb；辅助气（N₂）5arb。质谱条件参数见表2。

2 结果与讨论

2.1 固相净化柱的选择 

固相净化柱相对于免疫亲和柱具有操作简便、成本较低的特点，但是不同的柱填料对粮谷中不同种类的真菌毒素净化效力有所不同。在实际测试中发现PriboSpin^TM100固相净化柱对粮谷中 11 种真菌毒素有良好的回收率且相对于免疫亲和柱具有成本低、能够同时净化多组分真菌毒素的特点。所以，我们推荐PriboSpin^TM100固相净化柱。

2.2 色谱条件的优化 

由于要同时兼顾质谱正负离子同时扫描，所以流动相选择了20mmol/L的乙酸铵与乙腈梯度洗脱，试验中得到的锋型良好。11种真菌毒素标准溶液MRM色谱图见图 1。

2.3 质谱条件优化

本试验由于采用正负离子同时扫描，而不分段同时正负离子扫描会大大降低仪器灵敏度，所以采取了分时段采集模式，并配合XTerra MS C18 色谱柱在保留时间完成正离子采集区域与负离子采集区域上的保留时间分离，相关质谱条件参数见表2。

2.4 方法线性及检出限

将11种真菌毒素的混合标准溶液配置成系列浓度，以响应强度的峰面积为纵坐标，以质量浓度（μg/L）作为横坐标，绘制标准系列曲线，线性方程见表3。

将线性范围最低浓度点稀释并上机测定，以3倍信噪比（S/N）响应时所对应的浓度（μg/kg）作为检出限，以10倍信噪比（S/N）响应时所对应的浓度（μg/kg）作为定量限，结果见表 3。

图 1 11 种真菌毒素标准溶液 MRM 色谱图

Fig.1 MRM chromatograms of 11 mycotoxins

2.5 方法回收率及精密度

选择空白小麦粉样品分高、中、低3个浓度进行加标回收试验，高、中、低组加标回收试验分别添加2、10、20μg/kg质量浓度的混合标准物质，按照1.3所述样品前处理方法进行处理后测定加标回收率，并同时进行6次平行测定，考察方法精密度。试验结果显示各种真菌毒素的回收率范围为72.4%～90.7%，精密度范围为6.2%～11.8%。

3 结论

以小麦粉为研究对象，建立了超高效液相色谱串联质谱测定粮谷中11种真菌毒素的方法。该方法测定11种真菌毒素线性关系良好，加标回收测定率范围为72.4%～90.7%，方法精密度范围为6.2%～11.8%，11种真菌毒素的定量限范围为1.2μg/kg～2.0μg/kg，样品前处理条件具有较高的基质干扰消除能力且准确度、灵敏度高，能够满足小麦粉中真菌毒素的检测要求。

方法来源：李磊,李海畅,周贻兵,林野.液相色谱-串联质谱测定小麦粉中11种真菌毒素[J].食品研究与开发,2016,37(03):156-160.特表示感谢！

Pribolab产品订购信息

液相色谱柱•固相净化柱•处理耗材

标准品

质控样品

*此类为自然污染物质，每批次供应量有限，不同批次产品浓度不同。

辅助耗材设备

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