饲料中三聚氰胺检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2021 Knowledge Optimized Laboratory 解决方案 全自动固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定饲料中的三聚氰胺 三聚氰胺；全自动固相萃取；全自动氮吹浓缩仪；液相色谱-中联质谱法；饲料 介绍 三聚氰胺俗称密胺、蛋白精，是种用途广泛的有机化工中间品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂的原料，还可用作阻燃剂、减水剂和甲醛清洁剂等。由于其含氮量高达66.7%，色色无味易被染色，传统的凯氏定氮法又无法将其检测出出，故不法商人将其添加到蛋白饲料中或将其制成饲料添加剂冒充粗蛋白，对畜牧养殖业和人类健康造成了严重危害。 1.介绍 三聚氰胺俗称密胺、蛋白精，是一种用途广泛的有机化工中间品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂的原料，还可用作阻燃剂、减水剂和甲醛清洁剂等。由于其含氮量高达66.7%，无色无味易被染色，传统的凯氏定氮法又无法将其检测出来，故不法商人将其添加到蛋白饲料中或将其制成饲料添加剂冒充粗蛋白，对畜牧养殖业和人类健康造成了严重危害。 图-1三聚氰胺结构式 本文参考 NY/T 1372-2007 《饲料中三聚氰胺的测定》的前处理方法，试样用1%三氯乙酸溶液提取，使用阳离子交换固相萃取柱经睿科 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪净化，洗脱液经 Raykol EVA 80 全自动氮吹浓缩仪吹干，20%乙腈水溶液复溶，高效液相色谱-串联质谱检测，内标法定量。添加上机浓度为1.0 ug/mL的加标实验，得到三聚氰胺的加标回收率在 84%-94%之间， RSD 值小于5%，表明该方法准确度高、精密度好，可以满足饲料中三聚氰胺的检测需求。 关键字：三聚氰胺；全自动固相萃取；全自动氮吹浓缩仪；液夜色谱-串联质谱法；饲料 2.仪器与耗材 全自动固相萃取仪：睿科RaykolFotector Plus 全自动氮吹浓缩仪：睿科Raykol EVA-80 全自动液体处理工作站：睿科Raykol Auto Prep 200高效液相色谱 (HPLC) Agilent 1260，质谱检测器 (MS) Agilent 6410 固相萃取小柱： ： MMCCXX，， 60 mg/3mL (RayCure，货号： RC-204-72855) 乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，三氯乙酸(分析纯)，氨水(分析纯)：：含量为25%~28% 乙酸铵溶液(10 mmol/L)：准确称取 0.772 g 乙酸铵于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀备用。 20%乙腈水溶液：准确量取乙腈 20 mL 与超纯水80mL， 混匀后备用。 1%三氯乙酸溶液：：称取 10 g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。 5%氨化甲醇溶液：准确量取5mL 氨水和 95 mL甲醇，混匀备用。 3.标准曲线配制 使用睿科 Raykol Auto Prep 200 可实现标准品的全自动化配制，可将母液(1000 ug/mL)通过工作站的直接稀释模式，配制一条浓度分别为 1.0 ug/mL，5.0 ug/mL，10.0 ug/mL，25.0 ug/mL和50.0 ug/mL 的标准工作曲线。 图-2 Auto Prep 200 液体工作站配标程序 4.样品前处理 4.1提取 称取5g(精确至0.01g)试样于100 mL离心管中，加入50 mL1%的三氯乙酸溶液，摇匀，超声提取 20 min。在10000 r/min 离心机上离心5 min， 取 10 mL 上清液于玻璃上样管中，待净化。 4.22 净化与浓缩 表-1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科 Raykol Fotector Plus 固相萃取柱 MCX(RayCure， 60mg/3mL) 活化 甲醇、水 淋洗 水、甲醇 洗脱 5%氨水甲醇 将 MCX小柱安装在仪器上，分别用3mL甲醇和3mL 水以2mL/min 速度活化，将上述待净化液以1 mL/min 上样，用3mL水清洗样品瓶，然后用3mL甲醇以2 mL/min 速度淋洗固相萃取柱，用气推的方式压干小柱。最后用5 mL氨化甲醇以1 mL/min速度洗脱，洗脱液用睿科 RaykolEVA-80 全自动氮吹浓缩仪在50℃、1L/min 的条件下吹干，残渣用1 mL 20%乙腈水溶液复溶，过微孔滤膜后上机检测。详细步骤见图-3。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间minL， 1 清洗样品通道 甲醇 1.3 2 活化 甲醇 有机废液 2 3 1.9 3 活化 水 有机废液 2 3 1.9 4 上样 有机废液 1 10 10.8 5 清洗样品瓶 水 有机废液 60 3 3.8 6 淋洗 甲醇 有机废液 2 3 1.9 7 气推 有机废液 80 30 2.2 8 清洗注射泵 5%氨化甲醇 60 5 0.5 9 洗脱 5%氨化甲醇 收集 1 5 5.4 10 气推 收集 1 2 2.4 11 气推 收集 20 10 1.3. 12 结束 13 图-3. Fotector Plus 饲料中三聚氰胺固相萃取方法 5.1液相色谱-质谱联用条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5umx21×50mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A：10mM ammonium acetate B： acetonitrile 柱温 30°C 进样体积 5 pL 检测器 MS/MS 6410 离子模式 ESI+ 吹扫气 11L/min 氮气温度 350C 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 洗脱梯度 A：B=50：50 5.2 MRM 参数 化合物 母离子(m/z) 定量子离子(m/z) 定性子离子(m/z) 碎裂电压(v) 碰撞能量(ev) Melamine 127 85.2 68.2 100 20 Melamine-13C3 130 87 / 100 20 5.3色谱图 图-4.三聚氰胺标准品色谱图(1.0pg/mL) 6.加标测试 取空白试样5 g， 添加上机浓度为 1.0 ug/mL 的三聚氰胺标准品，进行上述前处理，回收率结果如下表-3所示。 表-2添加实验的回收率及相对标准偏差结果(n=4) 化合物 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) Si S2 S3 S4 三聚氰胺 90.6 93.5 84.0 86.4 88.6 4.8 7.结果与讨论 7.1使用离子交换柱进行固相萃取时，为使目标物在柱子上得到较好的保留效果，上样流速应控制不能超过1 mL/min，否则将导致回收率偏低。 8.总结 8.1.采用睿科 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪能同步进行6个样品净化，连续自动处理60个样品，做样通量高；同时可无人值守，大幅度减少了工作人员的工作量，提高了工作效率。此外还可避免工作人员因操作失误导致的检测偏差，也可将实验人员更迭对检测结果的影响最小化。 8.2.睿科Raykol Auto Prep 200 全自动液体工作站可实现混标、标准曲线的配置，全程无需人为值守，让实验人员远离有毒有害物质，保护身体健康。 8.3.睿科 Raykol EVA 80 全自动氮吹浓缩仪处理通量高，80个样品可同时进行氮吹，实验平行性好；而且采用氮吹针自动追随液面设计，无需手动调节氮吹针高度且耗气量小，省时省力。 Raykol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2020年10月版 邮箱： info@raykol.com热线：址：：Vwww.raykol.com 邮箱： info@raykol.com网址：：Vwww.raykol.com热线： 本文参考NY/T 1372-2007 《饲料中三聚氰胺的测定》的前处理方法，试样用1%三氯乙酸溶液提取，使用阳离子交换固相萃取柱经睿科Raykol Fotector Plus全自动固相萃取仪净化，洗脱液经Raykol EVA 80全自动氮吹浓缩仪吹干，20%乙腈水溶液复溶，高效液相色谱-串联质谱检测，内标法定量。添加上机浓度为1.0 ug/mL的加标实验，得到三聚氰胺的加标回收率在84%-94%之间，RSD值小于5%，表明该方法准确度高、精密度好，可以满足饲料中三聚氰胺的检测需求。