液体样品中荧光光谱检测方案(分子荧光光谱)

HITACHI 日立1nspire the Next 液体样品的荧光测定技巧 1.概要 荧光分光光度计灵敏度高，能够对液体和固体样品的荧光物质进行定性和定量分析。本文主要介绍液体样品的荧光测量技巧。 2.测量技巧 2.1注意样品的浓度 对于一般的液体样品，直接使用10mm 的常规石英比色皿测定即可。但若样品的浓度太高，则会出现内滤效应，即样品会对激发光或发射光产生吸收，导致获得的荧光强度偏低。 图1低浓度样品的测定 图2高浓度样品的测定 如图所示，低浓度的样品所有位置均会产生荧光，检测器可以接收到所有荧光信号。高浓度的样品在液体表面产生荧光，检测器无法接收到全部荧光，会出现标准曲线线性偏移。 图3罗丹明B的线性关系(普通测光方式) 因此，测定高浓度样品时，由于高浓度样品的吸光度高，激发光无法到达液体内部。为获得线性标准曲线，一方面激发波长处的吸光度最好低于0.02，另一方面选用表面测光方式可以准确获得荧光光谱，常用的表面测光附件有固体样品支架、三三角样品池。 图3固体样品支架 图4三角样品池 图5罗丹明B的线性关系(表面测光方式与普通测光方式对比) 表面测光方式中也要注意样品自吸收的影响，浓度过高的样品，还会发生荧光峰向长波长方向的移动。 1.07 图6样品的吸收光谱 图7不同浓度样品的荧光光谱 2.2注意样品的PH值 不同样品在不同 PH 值下测得的荧光强度不同，尤其是含羟基和氨基的荧光性分子，酸解离常数对光谱数据和荧光强度会产生较大的影响。 图8荧光素荧光强度随 PH值的变化 中性 碱性 图9不同PH值下的样品 2.3注意样品中的溶解氧 溶解氧对一些的样品具有荧光消光效应，其消光程度取决于荧光分子量。而且它会影响荧光强度及量子产率。通过使用带盖样品瓶，在数分钟内吹入氮气，可去除溶解氧。 图10脱气和未脱气甲苯中 Ir(ppy)3 的荧光强度对比 2.4注意样品的温度 考虑温度的影响，有的样品受温度影响较大，一般随温度升高荧光强度会减小。因此测定受温度影响较大的样品时，应在恒温条件下测试。 图11普通药品的荧光强度随温度的变化 1500 图12荧光光谱随温度的变化 2.5注意激发光的影响 若样品对激发光的照射敏感，则需要使用高灵敏度、高扫描速度的仪器，按照以下方式设置合适的条件，实现稳定测量。一是扫描速度设置为快速。在可接受的噪音范围内，尽量提高扫描速度。此外，通过 CAT(Computing for Averaging Transient) 可有效获得平均光谱。二是缩小激发侧狭缝，，当样品荧光强度足够时，可缩小激发侧狭缝。当灵敏度低时，可增加发射侧狭缝，以提高感光度。 图13荧光色素的荧光光谱(一般测定，扫描速度设为 300nm/min) 图14荧光色素的荧光光谱(高速测定，扫描速度设为3000nm/min) 2.6注意污染的控制 在测定液体样品的过程中，对于污染的控制，，一是溶剂的选用，用于定量分析的试剂，其纯度十分关键。有些情况下，特级试剂中的杂质可能会产生荧光，有些杂质还可能会和试剂发生反应。目前市场上有荧光专用的分析试剂。 图15荧光分析专用试剂 测定低浓度物质时，还需注意纯水的浓度，超纯水比纯水的背景吸收更小。此外，在使用自来水清洗器具后，使用纯水或超纯水再清洗一遍效果更佳。 图16不同纯水的荧光强度 二是注意容器类别的选择，推荐使用玻璃器具，若测定微量物质时，应该使用专用器具。塑料器具不适合微量物质的检测。 图17塑料器具和玻璃器具 三是注意容器材质产生的污染，在测定有机溶剂时，若使用塑料容器，容器中的增塑剂析出会造成污染，引起背景信号上升。 图183二氯甲烷的测定(左为玻璃容器，右为塑料容器) 2.7注意样品池的选择 一是样品池的安装，保持样品池的摆放方向一致。样品池不同面的透过率不一样，由此造成荧光强度不同。使用不同的样品池，在不同的方向测定纯水，结果如图19所示。 图19样品池各面的荧光强度 二是样品池的类型，对于挥发性溶剂的测定，建议使用带盖样品池，防止溶剂挥发，使测量更稳定。 三是样品池的材质，玻璃样品池在紫外区会发出荧光。因此，不适合紫外区样品测定，应使用合成石英材质的样品池。 四是样品池的清洗，清洗过程请勿破坏光学表面，应将样品池浸至专用清洗剂中清洗。 图20样品池清洗示例 3.总结 在进行液体样品的荧光测定时，对于样品前处理和测定过程需要注意以下几点： 1)测定高浓度样品时，注意内滤效应和自吸收的影响。 2)对于荧光特性受 pH 值影响的样品，应选择合适的 pH 值进行测定。 3)溶解氧会消除样品荧光时，应对样品进行脱气处理并置于带盖样品池中测定。 4)对于具有温度特性的样品，应控制在恒温条件下测定。 5)对于易分解的样品，应选择合适的扫描速度和狭缝宽度。 6)注意溶剂、纯水的纯度、容器的污染。 7)注意样品池的摆放方向，选择满足测量目的的样品池。 荧光分光光度计灵敏度高，能够对液体和固体样品的荧光物质进行定性和定量分析。本文主要介绍液体样品的荧光测量技巧，在样品前处理和测量过程中需要注意的事项。