新鲜牡蛎中碱性磷酸酶的分离提取及比活力检测方案(氮吹仪)

来亨科学仪器Laiheng Lab-Equipment 新鲜牡蛎中碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定 一、实验原理 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为 ALPase)广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中， ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase 与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase 的作用最适 PH 在碱性区域，一般在 PH9.0~10.5范围内。Mg²+对该酶的活力有显著的激活使用。 为了获得好的提取效果，在酶的制备过程，特别应注意以下几点： (1) 选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。 (2)用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是最常用的盐。操作时，要注意保持缓冲液 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细，需缓慢加入并及时搅拌溶解，尽量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀，要静置20min 以上，以使沉淀完全，然后方可时行离心分离。 (3)有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作，缓慢加入，充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后，最好立即将其溶于适量缓冲液中，以避免酶活力的丧失。 (4)在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步聚才有效。 酶活力的分析：通常是以对一硝基苯磷酸二纳(pNPP)为底物，在PH10.1的碳酸盐缓冲液(含2mmol/LMg)的测活体系中检测酶催化 pNPP水解产生黄色的对硝基苯(pNP) 在 405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405 值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2mmol/LMg²+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每 mg 蛋白所具有的酶活力单位数。 蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenolreagem)显色法，详见北京来亨科贸有限责任公司技术文章。 二、实验用品 (一)器材 (1)高速组织捣粹机和玻璃匀浆器。 (2)离心机。 (3)超级恒温水浴锅。 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) (4)酸度计。 (5)722分光光度计。 (6)天平、台秤。 (7)透析袋。 (8)磁力搅拌器。 (9)冰箱。 (10)秒表。 (11)50uL微量进样器。 (二)试剂 (1)含 0.1mol/L NaCl 的 0.01mol/L Tris HCL PH7.5 缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷 1.214g，NaCl5.8g， 溶于蒸馏水中，加入80ml 0.1mol/L HCL， 用蒸馏水定容到1000ml。 (2)正丁醇(分析纯)。 (3)硫酸铵(分析纯)。 (4)0.5%NaCl：称取5g NaCl 溶于1000 mL 蒸馏水中。 (5) 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3 pH 10.1缓冲液：分别取(A)液 70mL，(B)液30ml混匀，用酸度计准确调节 pH 10.1。 (A) 0.1 mol/L Na2CO3溶液：取 28.6gNa2CO：10H20溶于1000 mL蒸馏水中。 (B) 0.1 mol/L NaHCO3溶液：取 8.4gNaHCO3 溶于1000 mL 蒸馏水中。 (6)0.5 mol/L醋酸镁溶液：称取醋酸镁107.25 g 溶于蒸馏水中，稀释成1000ml。 (7) 0.1 mol/L醋酸钠溶液：称取醋酸钠8.2g溶于蒸馏水中，稀释至1000 ml. (8) 0.01 mol/L醋酸镁-0.01 mol/L醋酸钠溶液：取0.5 mol/L醋酸镁20ml醋酸钠100 mL，混匀北京来亨科学仪器有限公司 3 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 景盛南二街33号4号楼4层 后加蒸馏水稀释至1000 ml. (9) PH8.8 Tris.HCI缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1g， 用蒸馏水溶解。并稀释至1000ml，即为 0.1 mol/L Tris 溶液。取 0.1 mol/L Tris 溶液100mL， 加蒸馏水约800ml， 再加 0.1 mol/L 醋酸镁100 mL， 混匀后用1%醋酸调节 pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000ml即可。 (10) 丙酮(分析纯)。 (11)95%乙醇(分析纯)。 (12) 20 mmol/L Mgcl2：称取 1.904 g Mgcl2溶于 1000ml蒸馏水中。 (13)0.1mol/L NaOH：称取 4g NaOH 溶于 1000ml蒸馏水中 (14)20 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠(pNPP)：称取 371.2 mg pNPP 溶于50ml蒸馏水中。 (15)底物溶液(5mmol/LpNPP)：按以下比例混句(5)：(6)：(8)：H2O=l：0.2：0.50：.28. (16)0.5umol/mL对硝基苯酚 (pNP=141.1)溶液：精确称取 17.64mg对硝基苯酚，用蒸馏水溶解并定容至250mL。 (17) Folin 甲参考北京来亨科贸有限责任公司技术文章。 (18) Folin 乙参考北京来亨科贸有限责任公司技术文章。 (三)材料 (1)新鲜牡蛎。 (2)新鲜兔肝。 三、实验程序 (一)操作方法 1.牡蛎碱性磷酸酶的分离提取 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A (1)称取 100g牡蛎(蒸馏水洗净)，加入150预先冷却的 0.01mol/L TrisHCL 缓冲液 (PH7.5，含0.1mol/LNaCl)，于高速组织捣碎机匀浆1min，量匀浆体积，于冰箱4℃放置 3h 进行抽取。 (留匀浆液10ml， 采用离心或过滤，得到上清液，待测酶的比活力) (2)缓慢加入20%(V/V)冰冷的正丁醇，边加边搅拌均匀。冰箱放置 2~3h。 (3)室温离心， 4000r/min 30min，收集离心上清液，并量体积。。(留5ml上清液，对含 0.1mol/L NaCl的0.01mol/L TrisHCL 缓冲液 PH7.5透析平衡，待测酶的比活力。)(4)在正丁醇处理的上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35 饱和度(100ml加入20.9g)。缓慢加人，元不断搅拌溶解，置冰箱静置4h。 (5)室温离心， 4 000 r/min 30 min， 收集离心上清液，并量体积。。(留5ml上清液， 对0.01mol/LTrisHCL缓冲液 PH7.5含0.1 mol/L NaCl透析平衡，待测酶的比活力)。 (6) 0.35 mol/L饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度(100ml加入23.8g)。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置4h. (7)室温离心，4 000 r/min 30 min，收集沉淀物。 (沉淀蛋白上浮，先把下面清液虹吸出来，余少量清液连同沉淀一起离心) (8)得到沉淀物，溶于20mL 含 0.1mol/LNaCl 的 0.01mol/L risHCL 缓冲液 PH7.5。装入透析袋，先对预冷的 0.5% NaCl透析(常换透析液)， 至无SO4被检测出为止(可用一定浓度 BaCl2溶液检验)。再对 0.01 mol/L Tris·HCl pH7.5缓冲液透析平衡。 (9)取出酶溶液，冷冻高速离心(0℃：25 000 r/min 30 min)。(10)离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装人棕色瓶于4℃冰箱保存。 2.兔肝碱性磷酸酶的分离提取 (1)取2g新鲜免肝剪碎后，置于玻璃匀浆管中，加入0.01 mol/L醋酸镁， 0.01 mol/L醋酸钠 6ml， ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 研磨2一3 min。将匀浆倒入刻度离心管中，记录其体积。吸出0.1ml 置于另一试管中，在此试管中加 4.9mlPH8.8 Tris ·HCI缓冲液稀释，待测比活力。 (2)加2ml正丁醇于匀浆中，用玻璃棒充分搅拌2 min 左右，然后在室温中旋转 20min。用滤纸过滤，滤液置于刻度离心管中。 (3)滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心(2000 r/min)5min， 弃去上清液。在沉淀中加入0.5 mol/L 醋酸镁4mL， 用玻璃充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。吸取 0.1ml。置于另一试管中，在此试管中加入 PH8.8 Tris ·HCI缓冲液4.9ml， 待测比活力。 (4)在溶液中缓慢加人冷95%乙醇，使乙醇最终浓度达30%，混匀后离心(2000r/min) 5min， 将上清液倒人另一离心管中，弃去沉淀。上清液中加人冷95%乙醇，使乙醇最终浓度高达60%，混匀后离心(2500 r/min)5 min， 弃去上清液，沉淀中加人0.5 mol/L 醋酸镁3ml，使其充分溶解，并记录体积。吸取0.2mL置于另一试管中，加入pH8.8 TrisHCI缓冲液 3.8ml， 待测比活力。 (5)上述溶液中逐渐滴加人冷丙酮。使丙酮最终浓度达33%。混匀后离心((2000 r/min)5 min， 弃去沉淀，上清液则在另一刻度离心管中再缓慢加入冷丙酮。使丙酮最终浓度达50%。混匀后离心((4000r/min)10 min，， 弃去上清液，沉淀即为部份纯化的碱性磷酸酶。此沉淀中加入 pH8.8 Tris HCI缓冲液 4ml使其溶解，并记录体积，吸取0.5 mL 置于另一试管中，加入 pH8.8 Tris HCI 缓冲液 2mL稀释，待测比活力。 3.比活力测定 (1)对硝基苯酚标准曲线的制作：取15支试管编号，0号一支，1~7号各二支，按表10-1操作： ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) ( 技术中心：北京金桥科技产业基地 ) 景盛南二街33号4号楼4层 表10-1 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 pNP含量/umolL- 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.5umol/ml pNP/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 H2O/ml 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Na2CO3-NaHCO3/ml 20 mmol/L MgCl2/ml 0.1 mol/L NaOH/ml 以对硝基苯酚的绝对量 (umol/L) 为横坐标，OD405值为纵坐标，绘制标准曲线。示出 pNP的克分子消光系数(E)值。 (2)酶活力的测定：取干净的试管21支，编号，0号一支作为空白对照，以缓冲液代替酶液；1~4号各3支，作为各步的酶样测定；1'一4'各2支，作为相应的样品对照；各管加入1.98ml底物溶液(试剂9)，于37℃恒温水浴中预热5 min， 1一4号管分别加人各步酶样20pl，精确反应 10min，各管加入2 mL 0.1 mol/LNaOH 终止反应并显色，0号加入20p1 Tris . HCI缓冲液代替酶液，1'一4'管先加入NaOH 后再分别补加对应的酶液20ul。以0号管调零点，于722分光光度计测定各管的OD405值，各个测定管的平均 OD值减去对照管的平均OD 值，从对照标准曲线求出产物的umol数，算出酶活力。 (3)蛋白农度的测定：上述分离提取的四步酶制剂按一定比例用 Tris .HCI 缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定，以1步骤所提的碱性磷酸酶为例，，一般第一步和第四步稀释40一50倍，第二步稀释5一10倍。第三步稀释2一5倍。 取干净的试管13支，编号，0号一支作为空白试验，加入 0.5 mLTris . HCI 缓冲液稀释 PH7.5；1~4号管各3支，作为各步的酶样测定，各管加人相应的已稀释的酶液0.5 mL；各管加入Folin-酚试剂甲 4mL，室温放置 10 min， 再加入 Folin-酚试剂乙 0.5 mL， 混匀，放置30 min。以0号管调零点，于722分光 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) ( 技术中心：北京金桥科技产业基地 ) 光度计测定各管的OD650值，从对照标准曲线求出各样品的蛋白浓度。 4.结果处理 计算： C酶活力/U·mL1=-X AtxVD蛋白质浓度/mg·mL=×A×B0.5ml 式中：为透析后的体积变化系数；B为稀释倍数，C为由标准曲线查得的 pNP (mol/L)，t为反应时间，D为由标准曲得的蛋白的质量(mg)， V1为测定酶活力所用的酶量(ml)。 酶活力/U·mL 酶的比活力/U·mg1= ×A×B 蛋白浓度/mg·mL 北京来亨科学仪器有限公司 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心：北京金桥科技产业基地 景盛南二街33号4号楼4层 技术中心：北京金桥科技产业基地景盛南街楼层 京来亨科学仪器有限公司技术中心：北京金桥科技产业基地景盛南街楼层 一、实验原理碱性磷酸酶（alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase）广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中，ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域，一般在PH9.0~10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活使用。为了获得好的提取效果，在酶的制备过程，特别应注意以下几点：（1）选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。（2）用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是最常用的盐。操作时，要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细，需缓慢加入并及时搅拌溶解，尽量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀，要静置20min以上，以使沉淀完全，然后方可时行离心分离。（3）有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作，缓慢加入，充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后，最好立即将其溶于适量缓冲液中，以避免酶活力的丧失。（4）在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步聚才有效。     酶活力的分析：通常是以对—硝基苯磷酸二纳（pNPP)为底物，在PH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯（ pNP）在405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L  Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenolreagem)显色法，详见北京来亨科贸有限责任公司技术文章。 二、实验用品(一)器材    (1) 髙速组织捣粹机和玻璃匀浆器。    (2) 离心机。    (3) 超级恒温水浴锅。    (4) 酸度计。    (5) 722分光光度计。    (6)天平、台秤。    (7)透析袋。    (8)磁力搅拌器。    (9)冰箱。    (10)秒表。    (11)50µL微量进样器。（二）试剂     (1)含0.1mol/L NaCl 的0.01mol/L Tris.HCL PH7.5缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷1.214g，NaCl5.8g，溶于蒸馏水中，加入80ml 0.1mol/L HCL，用蒸馏水定容到1000ml。     (2)正丁醇（分析纯）。     (3) 硫酸铵(分析纯)。     (4) 0.5% NaCl：称取 5 g NaCl 溶于1000 mL蒸馏水中。     (5) 0.1 mol/L Na2C〇3-NaHC〇3  pH 10.1 缓冲液:分别取(A)液 70mL，（B)液30ml混匀，用酸度计准确调节pH 10.1。         (A) 0.1 mol/L Na2C〇3溶液：取 28.6 g Na2C〇3.10H20溶于1000 mL蒸馏水中 。             (B) 0.1 mol/L NaHC〇3 溶液：取 8.4 g NaHC〇3 溶于1000 mL蒸馏水中。     (6) 0.5 mol/L醋酸镁溶液：称取醋酸镁107.25 g溶于蒸馏水中，稀释成1000ml。     (7) 0.1 mol/L醋酸钠溶液：称取醋酸钠8.2 g溶于蒸馏水中,稀释至1000 ml。     (8) 0.01 mol/L醋酸镁-0.01 mol/L醋酸钠溶液：取0.5 mol/L醋酸镁20ml醋酸钠100 mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000 mL。    (9) PH8.8 Tris.HCl缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1 g，用蒸馏水溶解。并稀释至1000ml，即为0.1 mol/L Tris溶液。取0.1 mol/L Tris 溶液100mL，加蒸馏水约800ml，再加0.1 mol/L醋酸镁100 mL，混勻后用1 %醋酸调节pH至8.8,用蒸馏水稀释至1000ml即可。    (10) 丙酮(分析纯)。    (11) 95%乙醇(分析纯)。    (12) 20 mmol/L Mgcl2：称取 1.904 g Mgcl2溶于1000ml蒸馏水中。    (13) 0.1 mol/L NaOH：称取 4 g NaOH 溶于1000ml蒸馏水中。    (14)  20 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠（pNPP):称取371.2 mg pNPP溶于50ml蒸馏水中。    (15) 底物溶液(5mmol/L pNPP)：按以下比例混句(5):(6):(8):H2O=l:0.2：0.50:.28。    (16)0.5µmol/mL对硝基苯酚（pNP=141.1)溶液:精确称取17.64mg对硝基苯酚，用蒸馏水溶解并定容至250 mL。