肽类、蛋白质中缓激肽、后叶催产素、血管紧缩素II等成分检测方案(专用色谱柱)

LC Cafe espresso No.2017003-2017004 Proteonavi S5的溶出行为2~与他社色谱柱的比较及柱温的影响~Proteonavi S5的溶出行为3~柱温80℃条件下的耐久性及峰形考察~ Keywords： Proteonavi、肽类、蛋白质、缓激肽、0.1 vol% HCOOH、柱温80℃、耐久性、峰形 Proteonavi S5是一款以孔径为30 nm的硅胶作为基材、键合C4基团的蛋白质·肽类化合物分析色谱柱。上回的Espresso 2017002中介绍了以6种蛋白质作为样品， 将Proteonavi S5与他社色谱柱进行溶出行为比较的试验。 本次，以5种肽类化合物(缓激肽、后叶催产素、血管紧缩素II、神经降压素及血管紧缩素I)作为样品，将Proteonavi S5与一款填料表面带有正电荷的杂化型色谱柱(孔径13 nm、粒径3.5 um) 进行比较。图1为所得结果。流动相为添加了0.1 vol%甲酸的水-乙腈系统，在梯度条件下对两款色谱柱进行了溶出行为的考察。 结果，他社色谱柱对于肽类化合物的整体保留较弱，且缓激肽的峰未能得到确认；与此相对，Proteonavi S5对这5种肽类化导物均得到了良好峰形以及充分的保留与分离。 [min1 图1 两款色谱柱分析所得色谱图 【HPLC Conditions】 Column size Mobile phase ： 2.0 or 2.1 mm i.d. x150 mm： A)0.1 vol% HCOOH， H2O B) 0.1 vol% HCOOH， CH3CN B 15% (0 min)→30%(20 min) Gradient Flow rate ： 0.2 mL/min Temperature ：40°C Detection ： UV 220 nm nj. vol. ： 1pL Sample dissolved in：HO(100 pg/mL each) ~柱温与溶出行为~ 对肽类化合物进行分析，有提高柱温的做法。例如， 《第17改正日本药局方》中，环孢菌素是在柱温80℃附近的一定温度下进行分析的。 在此， 以环孢菌素A作为原料，在等度条件下对色谱柱柱温变化七相应的溶出行为进行了考察。图2为所得结果。 如图2，随着柱温的上升，环孢菌素A的保留逐渐减弱，峰形也愈发尖锐。一般来说，与小分子相比，大分子的扩散速度较慢，因此色谱峰形有展宽的趋势，而设定较高的柱温可以使峰形变得尖锐。像这样，在对肽类化合物进行分析时，设定较高柱温可以使分析时间缩短，提高定量准确性。 [min] 图2柱温与环孢抱菌素A溶出行为的关系 Column size ：2.0 mmi.d.x150 mm Mobile phase ：0.1vol% HCOOH， H2O/CHCN=45/55 Flow rate ： 0.2 mL/min Temperature ：40，50，60，70or 80℃ Detection ： UV 210 nm Inj. vol. ： 1 uL Sample dissolved in ：H2O/CHCN=50/50 (100 ug/mL) 接下来，在柱温80℃条件下对Proteonavi S5的耐久性进行了考察。图3为首次进样与连续进样第500针所得色谱图。在连续500次进样过程中(通液时间共计250小时)，环孢菌素A的保留时间维持率(首次进样与第500次进样对比)近乎100%，峰形(理论塔板数N及对称因子S)也几乎没有变化。 综上所述，Proteonavi S5色谱柱即使在80℃的高柱温条件下也导得到非常稳定的分析结果。 图3环孢菌素A的保留时间维持率(%)与首次进样和连续500次进样所得色谱图 【HPLC Conditions】 Column size ： 2.0 mm i.d. x 150 mm Mobile phase ：0.1vol% HCOOH，H2O/CH3CN=45/55 Flow rate ： 0.2 mL/min Temperature ：80℃ Detection ： UV 210 nm Inj. vol. ：1pL Sample dissolved in ：：H2O/CH3CN=50/50 (100pg/mL) 对于环孢菌素A这样的高分子化合物，随着柱温的上升，其扩散速度加快，因而峰形会更尖锐。进一步，针对提高柱温的效果，，以环状肽类化合物表面活性肽(M.W.1036.3)作为分析对象，将柱温分别设定为40℃和80℃进行分析。图4为分析所得结果。将柱温由40℃提高到80℃，保留变弱的同时，表面活性肽的理论塔板数提高了1400。 综上，在对肽类化合物进行分析时，在高柱温条件下使用耐久性良好的Proteonavi S5色谱柱进行分析，提高柱温是获得尖锐峰形的技巧之一；在缩短分析时间的同时，检测灵敏度和定量准确性也能得到提高。 (L-Leu) 图4 柱温40℃及80℃条件下对表面活性肽的分析色谱图 Column ： Proteonavi S5；2.0 mm i.d.x150mm Mobile phase ： 0.1 vol% HCOOH，H20/CH3CN=30/70 Flow rate ： 0.2 mL/min Temperature ：40 and 80 °C Detection ： UV 220nm Inj. vol. ： 2 pL Sample dissolved in ：CH3OH (100 pg/mL) Proteonavi S5的溶出行为2　～与他社色谱柱的比较及柱温的影响～Proteonavi S5的溶出行为3　～柱温80℃条件下的耐久性及峰形考察～　Keywords : Proteonavi、肽类、蛋白质、缓激肽、0.1 vol%HCOOH、柱温80℃、耐久性、峰形Proteonavi S5是一款以孔径为30 nm的硅胶作为基材、键合C4基团的蛋白质?肽类化合物分析色谱柱。上回的《Proteonavi S5的溶出行为～与他社色谱柱的比较～ 1》中介绍了以6种蛋白质作为样品，将ProteonaviS5与他社色谱柱进行溶出行为比较的试验。本次，以5种肽类化合物（缓激肽、后叶催产素、血管紧缩素II、神经降压素及血管紧缩素I）作为样品，将Proteonavi S5与一款填料表面带有正电荷的杂化型色谱柱（孔径13 nm、粒径3.5 μm ）进行比较。图1为所得结果。流动相为添加了0.1 vol%甲酸的水-乙腈系统，在梯度条件下对两款色谱柱进行了溶出行为的考察。结果，他社色谱柱对于肽类化合物的整体保留较弱，且缓激肽的峰未能得到确认；与此相对，Proteonavi S5对这5种肽类化合物均得到了良好峰形以及充分的保留与分离。图1　两款色谱柱分析所得色谱图～柱温与溶出行为～对肽类化合物进行分析，有提高柱温的做法。例如，《第17改正日本药局方》中，环孢菌素是在柱温80℃附近的一定温度下进行分析的。在此，以环孢菌素A作为原料，在等度条件下对色谱柱柱温变化及相应的溶出行为进行了考察。图2为所得结果。如图2，随着柱温的上升，环孢菌素A的保留逐渐减弱，峰形也愈发尖锐。一般来说，与小分子相比，大分子的扩散速度较慢，因此色谱峰形有展宽的趋势，而设定较高的柱温可以使峰形变得尖锐。像这样，在对肽类化合物进行分析时，设定较高柱温可以使分析时间缩短，提高定量准确性。图2柱温与环孢菌素A溶出行为的关系图3环孢菌素A的保留时间维持率（％）与首次进样和连续500次进样所得色谱图对于环孢菌素A这样的高分子化合物，随着柱温的上升，其扩散速度加快，因而峰形会更尖锐。进一步，针对提高柱温的效果，以环状肽类化合物表面活性肽（M.W. 1036.3）作为分析对象，将柱温分别设定为40℃和80℃进行分析。图4为分析所得结果。将柱温由40℃提高到80℃，保留变弱的同时，表面活性肽的理论塔板数提高了1400。综上，在对肽类化合物进行分析时，在高柱温条件下使用耐久性良好的ProteonaviS5色谱柱进行分析，提高柱温是获得尖锐峰形的技巧之一；在缩短分析时间的同时，检测灵敏度和定量准确性也能得到提高。图4　柱温40 ℃及80 ℃条件下对表面活性肽的分析色谱图