大鼠脑图谱

由华中科技大学武汉光电国家实验室(筹)骆清铭教授、龚辉教授研究团队获取的一套大鼠全脑高分辨数据集，近期发布在欧盟人脑计划(Human Brain Project, HBP)的神经信息平台(Neuroinformatics Platform, NIP)上。这标志着该团队建立的“鼠脑最精细脑图谱基础数据库”为欧盟人脑计划正式采用。　　此次发布在HBP-NIP上的数据集由该研究团队独立完成，样本为Golgi-Cox法染色的Sprague Dawley大鼠全脑，用显微光学切片断层成像(MOST)系统获取了全脑图像，成像分辨率为 0.35μ m×0.35μ m×1μ m，共包含16216层矢状原始切面。该数据集也同时在全脑网络可视化(Visible Brain-wide Networks, VBN)网站进行了共享，访问地址为 https://vbn.org.cn/2D/id3.html。　　HBP是2013年经欧盟委员会批准发起的旗舰级拨款项目，汇集了欧洲神经科学领域的众多科研团队与神经科学前沿研究课题，有超过120个参与机构和10亿欧元的项目资金。神经信息平台是HBP的重要组成部分，用于神经科学数据的发布与检索，近期发布的是神经信息平台的第一个公开版本，可直接通过 https://nip.humanbrainproject.eu 访问。HBP还同时发布了脑模拟平台、高性能计算平台、医学信息平台、神经形态计算平台和神经机器人平台，可通过 https://collab.humanbrainproject.eu 注册、登录和使用。

2021年4月，中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室再帕尔阿不力孜、贺玖明团队在分析化学一区《Analytical Chemistry》期刊发表封面文章，题为“Mapping metabolic networks in the brain by using ambient mass spectrometry imaging and metabolomics”的研究成果，采用自主研发的质谱成像空间代谢组学技术，全面绘制了大鼠脑代谢网络，深入解析了东莨菪碱致大鼠记忆功能障碍模型脑的代谢变化。　　封面文章　　研究背景　　大脑是结构最复杂的器官之一，主要功能与其微区的分子相互作用密切相关。大脑的小分子调节机制对理解中枢神经功能、精神疾病机理和药物研发有很大的帮助。动物的认知过程和行为控制均依赖于脑部强大的中枢神经网络——神经连接体。科学家进行了很多研究，但是对脑部小分子网络的研究仍有不足。　　分子成像技术是研究大脑中DNA、RNA、蛋白质和代谢产物的强大工具。质谱成像技术(MSI)是一种检测大脑中蛋白质、代谢物和脂质物质的高灵敏度和高通量分子成像技术，在肿瘤边缘诊断、肿瘤生物标志物发现、药物分布和机理阐述等领域有广泛的应用。　　本文作者开发了一种基于敞开式空气动力辅助解吸电喷雾离子化质谱成像(AFADESI-MSI)技术的代谢网络映射方法，对大鼠脑不同极性的小分子代谢物(m/z 50-500 Da)进行微区分布研究，不仅鉴定出脑部几乎所有重要的代谢物，还绘制了包含神经递质、嘌呤，有机酸，多胺，胆碱、碳水化合物和脂类等20条通路的代谢网络，并使用这种代谢网络映射质谱成像方法解析了东莨菪碱致大鼠记忆功能障碍模型脑的代谢变化，为中枢神经系统疾病的治疗提供新的信息和见解。研究思路　　研究方法　　1.样本准备　　Sprague-Dawley大鼠模型腹腔注射东莨菪碱后被杀死(处理组，3只)，对照组大鼠(3只)也用同样方法杀死。获取大鼠整个大脑，在低温下将大脑切成连续的矢状切片(暴露出海马和纹状体)，用于Nissl 染色、H&E染色和质谱成像检测。　　2.空间代谢组实验　　使用AFADESI-MSI分析，代谢物质量数范围50-500 Da，质谱分辨率70,000。　　3.数据处理和代谢网络分析　　原始数据经过转化，再使用自建MassImager软件获取成像结果 在获取差异代谢物的高分辨率质谱信息后，使用Metaboanalys在线数据挖掘软件以褐家鼠(rattus norvegicus)为参考完成代谢物高通量定性，并输出代谢网络信息。大脑中复杂网络可视化使用Cyctoscope软件完成。　　4.统计分析　　两组大脑样本选择相同的微区，并将组织学和特征离子图像叠加进行确认。数据处理结果使用t检验(n = 3)进一步验证。大脑微区包括松果体、中脑导水管、脑桥、梨状皮质、延髓、丘脑、纹状体、海马、胼胝体、嗅球、大脑皮层、小脑皮层、穹窿、小脑延髓和丘脑。　　研究结果　　1.AFADESI-MSI用于大脑中极性代谢物的定位　　如图1所示，将大鼠大脑连续矢状切面通过ESI探针对逐个像素进行扫描，并将解吸的代谢物离子传输到高分辨率质量分析仪进行分析。图1E是大鼠脑部某个像素点的一个代表性质谱图，在该图中可以观察到数千个代谢物的峰。AFADESI-MSI图像还表明脑部不同功能性区域中代谢物浓度的变化。图1A-D显示了代表性代谢产物图像，在松果体、纹状体、海马、胼胝体和嗅球等亚区域具有特定分布。这些异质代谢分布与大鼠脑的功能和结构复杂性高度一致。　　实验结果表明，AFADESI-MSI的空间分辨率小于100μm，代谢物质量最大差异为0.001Da，同一物质的检测动态范围高达1000倍。如图1所示，通过AFADESI-MSI可在大鼠脑部检测到一些呈特征性分布有代表性的极性代谢物，其强度范围从0到104甚至到106。　　图1 (A-E)使用AFADESI-MSI获得的用于构建大鼠大脑代谢网络图的代表性极性内源性代谢物 　　(F)AFADESI-MSI数据采集过程 　　2.在大鼠脑绘制特定区域分布的极性代谢物图谱　　使用AFADESI-MSI在正离子和负离子模式下分别获得298个和372个微区轮廓清晰的代谢物离子图像。使用精确分子量并结合同位素丰度，通过人类代谢组数据库(HMDB)对离子图像进行识别，鉴定出多种内源极性代谢物，包括氨基酸、核苷酸或核苷、碳水化合物、脂肪酸和神经递质等。　　中枢神经系统(CNS)的特定功能和特定解剖区域相关。例如，乙酰胆碱在大脑皮层中高度表达 γ-氨基丁酸是一种抑制性神经递质，其在大脑皮层的信号强度较低，在中脑、嗅球和下丘脑中的浓度较高 多巴胺在纹状体含量较高 组胺(一种兴奋性神经递质)主要分布于丘脑和下丘脑。松果体在睡眠和光周期调节中起着重要的作用，并且由于其体积小容易被忽视。在松果体区域中，作者检测到106种极性代谢物，例如吲哚乙醛、吲哚、5' -甲硫基腺苷和褪黑激素，它们在该微结构的表达最高。褪黑激素由松果体分泌，起到调节昼夜节律的作用。质谱成像结果表明褪黑激素只能在松果体检测到。褪黑激素的上游代谢物血清素(5-HT)在松果体中也有特定的分布。此外一些未知的代谢物也仅在大鼠大脑的某个很小但特定的区域中。以上结果表明，AFADESI-MSI方法可以直接检测极性代谢产物，并具有高特异性，能呈现其在大脑微区分布的图像。　　3.在大鼠脑中绘制微区代谢网络图　　要了解大脑的结构区域发生的复杂代谢过程，不仅应准确表征代谢物，还要研究其相关性。从大鼠脑微区中提取代谢谱进行代谢网络重建。从15个微区提取的MSI数据进行峰挑选和峰对齐(图1F)，包括松果体、中脑导水管、脑桥、梨状皮质、延髓、丘脑、纹状体、海马、胼胝体、嗅球、大脑皮层、小脑皮层、穹窿、小脑延髓和丘脑，然后使用基于KEGG数据库的Metaboanalyst软件进行代谢网络分析。共找到20条KEGG代谢通路，包含126个具有微区信息的代谢物，图2显示了涉及丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代谢、花生四烯酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、肌酸途径、GABA能突触、葡萄糖代谢、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢、甘氨酸-丝氨酸和苏氨酸的代谢、组氨酸代谢、赖氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、多胺代谢途径、嘌呤代谢、嘧啶代谢和TCA循环、色氨酸代谢、酪氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸和异亮氨酸代谢和类固醇激素合成途径。质谱成像方法提供了一种直接获取代谢网络信息的途径，以系统地深入了解大脑的代谢活动。　　图2 通过AFADESI-MSI和Metaboanalyst获得的大鼠脑中的代谢网络　　图3A展示了嘌呤代谢的分布和代谢途径，共包含17个核苷酸及相关代谢产物，饼图代表了某种代谢物在不同大脑微区的相对含量和分布，图3A中显示出不同代谢物的不同局部特征。例如腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)在大脑皮层和松果体中高表达，但在胼胝体和穹窿中含量较低。图3B显示了大脑不同区域的AMP分布，AMP在大脑皮层和松果体中含量很高，而在胼胝体和穹窿中含量较低。这些结果表明，大脑中代谢物分布呈现出功能性区域的差异性。这些空间和代谢途径的上游-下游转换过程为大脑局部代谢活动提供丰富信息。也证明质谱成像方法能够提供直接获取代谢网络信息的方法。　　图3 (A)通过AFADESI-MSI获得的大鼠脑中嘌呤代谢途径和相关代谢产物分布 　　(B)腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)在大鼠脑不同区域的分布 　　4.神经递质的代谢网络解析　　神经递质在大脑不同区域具有极为复杂的代谢调节网络，使这些区域的中枢神经能够从事复杂的活动。作者分析了关键神经递质的代谢调控网络，分别为多巴胺、γ-氨基丁酸、腺苷、组胺、乙酰胆碱、5-羟色胺、谷氨酸和谷氨酰胺。图4A显示了神经递质以及相关代谢产物在大鼠脑的分布特征，它们联系非常紧密(图4B)，这些神经元彼此相互作用并形成复杂的调节网络。　　图4 |(A)大鼠脑中神经递质及其相关代谢产物的分布 　　(B)神经递质调节和代谢网络 　　5.从大鼠脑的代谢网络映射中发掘空间变化　　东莨菪碱治疗的大鼠是一种学习和记忆障碍模型，通常用于研究抗遗忘药疗效。本文作者使用AFADESI-MSI分析了对照组和东莨菪碱治疗的大鼠矢状脑切片，将发现的代谢物全面映射代谢网络，并通过代谢组学分析发现空间代谢变化。不仅可以对药物准确定量，还可以检测代谢网络相关的数百种内源性代谢物在大脑特定区域的分布。图5显示了代谢网络中检测到的各种代谢物，以及在不同大脑微区代谢物的明显改变。如图5A所示，找到三种代谢物(N-甲酰基尿氨酸、L-色氨酸和5-羟色氨酸)，属于色氨酸代谢途径，意味着东莨菪碱会干扰色氨酸的代谢过程。作者分析了东莨菪碱治疗组大鼠脑的十个微区，发现脑桥中有16种表达异常的代谢产物，而在大脑皮层中发现了7种。表明在东莨菪碱治疗下，脑桥和大脑皮层可能是受影响最严重的区域。　　图5 东莨菪碱模型大脑中极性代谢网络的变化　　图6显示了其中几种异常表达的代谢产物的分布，例如腺嘌呤在小脑皮层被下调 组胺在中脑导水管中下调 桥脑中的磷酸乙醇胺、大脑皮层中的2-氧戊二酸、纹状体中的多巴胺、胼胝体中的抗坏血酸、下丘脑中的谷胱甘肽、小脑皮层中的L-天冬氨酸和L-天冬氨酸也有所变化，这些代谢物的质谱成像结果(图6A-H)和相对定量结果(图6I1-18)进一步表明，大脑中药物作用后代谢物的多样性和区域特异性。这些代谢物不分区分析、含量进行全脑平均后，代谢物的微区含量差异很容易被削减。在空间上的代谢变化表明，在东莨菪碱治疗后，大鼠脑微区的代谢网络发生紊乱。但是代谢物和代谢酶是代谢网络的关键因素，基于空间分辨的代谢组学信息为发现酶或基因异常提供了线索，但若要完成完整的代谢网络分析必须进一步验证蛋白质和基因表达水平。　　图6 在东莨菪碱治疗后大鼠模型的脑部质谱成像结果和代谢产物的统计结果　　研究结论　　本文作者开发了一种空间分辨代谢网络作图方法，通过无需衍生化、特定标记或复杂样品预处理的高通量AFADESI-MSI方法和代谢组学策略，在具有复杂结构化脑组织中发现代谢分子变化。能检测出多种极性内源性代谢物，并绘制相关代谢网络，提供组织微区分布的图谱。还将多种功能性小分子(例如核苷酸、多胺、肌酸、神经酰胺代谢物)含量分布可视化。这些代谢物构成大鼠脑关键代谢网络，为理解大鼠脑的作用机制和功能探索提供新的见解。在本文中，该方法被用于东莨菪碱处理的大鼠模型脑部的代谢研究。结合微区统计数据，该方法可以绘制代谢网络图、发现某些途径代谢产物的明显失调，而且还能描绘与神经疾病直接相关微区中发生的代谢变化。

Science期刊封面近日，由杭州华大生命科学研究院主导，联合来自3个国家的17个单位的科学家共同组成的研究团队分析比较了蝾螈脑发育和再生过程，构建了首个蝾螈脑再生时空图谱，这也是全球首个脑再生时空图谱。9月2日，相关成果以背靠背封面文章的形式发表于国际顶级学术期刊Science。至此，短短半年内，华大时空组学与单细胞技术的相关研究成果已连续四次在《细胞》《自然》和《科学》三大顶级期刊发表，实现了大满贯。人类大脑在受伤之后，很难自行恢复，但是两栖类模式动物墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）可以。大脑再生是一个复杂的生物学过程。在这个过程中，发生了哪些关键的变化，有哪些重要的细胞参与？它们又分别行使了哪些功能？通过研究，研究团队找到了蝾螈脑再生过程中的关键神经干细胞亚群，描绘了此类干细胞亚群重构损伤神经元的过程，同时还发现脑再生与发育过程具有一定的相似性，为认知脑结构和发育过程提供助力，为神经系统的再生医学研究和治疗提供新的方向。在具体的研究中，要知道大脑是怎么再生的，研究团队先要了解大脑是如何发育来的。于是，研究团队利用堪称超广角百亿像素“生命照相机”的时空组学技术Stereo-seq，在蝾螈脑发育的6个重要时期，分别“拍摄”“照片”，这组“照片”就构成了蝾螈的脑发育时空图谱。通过它们，研究团队能够“看到”蝾螈脑在发育的过程中，各类神经元的分子特征以及空间分布动态变化。结果发现，蝾螈脑从青少年时期就开始特化出具有空间区域特征的神经干细胞亚型。那大脑受到损伤后再生的过程是如何的呢？研究团队对蝾螈脑的皮层区域进行机械损伤手术，并在损伤后的第2、5、10、15、20、30及60天，利用时空组学技术Stereo-seq对大脑样本进行“拍照”，得到各个时间点的蝾螈脑再生图集，完整记录了蝾螈大脑从损伤，到再生修复完成的过程。这就像对蝾螈大脑恢复过程定期做一个X光检查。不过，得到的片子可比X光片清晰度高多了，不只能看到大脑的形状，还能持续放大，看到大脑里的细胞，以及细胞里的分子变化状态。通过对比7个时期再生“照片”和过程中的伤口状态，研究团队发现，伤口区域在损伤早期就出现了新的神经干细胞亚群，这群重要的细胞由损伤区域附近的其他神经干细胞亚群在受到损伤刺激后转化而来，并在后续的再生过程中新生出神经元以填补损伤部位缺失的神经元。此外，虽然伤口处在修复早期便开始逐步被新生组织填充，但直到损伤后第60天，“照片”才显示损伤区域的细胞类型及空间分布恢复到了未损伤侧的状态。蝾螈脑再生时空图谱图片来源于Science最后，研究人员还对比了蝾螈脑发育和再生过程的神经元形成过程，发现这一过程在再生与发育过程中高度相似，或许脑损伤诱导了蝾螈神经干细胞逆向转化，回到发育时期的年轻化状态，以启动再生过程。论文的共同通讯作者、杭州华大生命科学研究院顾颖博士表示：“蝾螈在进化上相较于其他硬骨鱼类更高等，与哺乳动物脑结构具有更高的相似度。同时，它的基因编码序列与人类极其相似，研究蝾螈脑再生的启动机制，发现其中的关键基因，或将为人类神经系统损伤或退行性疾病的修复提供重要指导。”蝾螈脑再生过程中的关键基因，在人类的基因序列中也存在。那为什么其没有像在蝾螈脑中一样发挥再生的作用？这或许会是科学家下一步研究的课题。技术的发展让本研究的推进成为可能，“本研究主要基于华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq进行，其达到了纳米级亚细胞分辨率，结合蝾螈细胞体积大的优势，使得研究人员可以在时空单细胞分辨率上解析蝾螈脑再生这一过程的重要细胞类型，并追踪其细胞谱系变化的空间轨迹。”论文的第一作者、杭州华大生命科学研究院魏小雨博士介绍说。“蝾螈脑发育及再生时空细胞图谱的构建，对于我们理解脑再生这一重要的生命过程、两栖类动物脑结构以及大脑结构的演化具有重要意义，为我们寻找有效的临床治疗方法，促进人类组织器官自我修复与再生提供了新的方向，也为物种进化研究提供了宝贵的数据资源。”论文的共同通讯作者、华大生命科学研究院院长徐讯表示，“未来，我们还将通过时空多组学技术去探究更多器官、更多物种的发育和再生过程，找到再生过程中的关键调控机制，助力人类再生医学的发展。”