2018/08/30 15:46
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产品配置单:
Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统
型号: 1260 Infinity II
产地: 德国
品牌: 安捷伦
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Agilent 1290 Infinity II Multisampler
型号: 1290 Infinity II Multisampler
产地: 德国
品牌: 安捷伦
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方案详情:
摘要
本应用简报介绍了一套完整的聚集体分析工作流程,它能够:
• 优化单克隆抗体高性能体积排阻色谱 (SEC) 的流动相条件
• 表征包括单体、二聚体和高阶聚集体等物质的聚集特征
我们使用安捷伦缓冲液顾问软件自动进行复杂的 SEC 优化实验,实验中充分利用 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色谱系统的功能,在一系列快速液相色谱运行中对各种缓冲液组分进行自动实时混合。Agilent 1260 Infinity Bio-MDS 多检测器套装提供了动态光散射检测功能,能够检测高阶蛋白质聚集体、测定绝对分子量并扩大紫外检测系统的测量范围。
前言
一些单克隆抗体 (mAb) 和蛋白质在溶液中容易自发聚集。在许多生物制药应用中,必须在各种条件下精确地表征和定量此类聚集的程度。体积排阻色谱 (SEC) 是一种表征和定量蛋白质聚集体的强大技术,但是准确测量需要在适合天然蛋白质确证的条件下具有优异的色谱性能。为通过改善特定蛋白质的色谱峰形提高其分离度,通常需要评估各种不同的流动相条件。
采用 SEC 技术时有时会忽略对缓冲液条件的优化。过去,通过优化缓冲液条件克服与固定相材料之间不必要的非特异性相互作用,但对色谱柱缺陷的优化有可能造成本用于测定聚集体的技术对待测聚集体造成破坏的风险。然而,Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱的惰性表面涂层有助于减少各种缓冲液条件下的次级相互作用,并提供更高的灵活性以优化用于蛋白质构象分析和色谱分离的缓冲液化学组成。参数筛选实验的复杂性是日常优化聚集体分析 SEC 缓冲液条件的另一障碍。优化实验需要设计复杂的备选流动相表格,并繁琐地手动配制许多不同的溶液以通过实验评估盐分基质、缓冲液和 pH 变化。然而,现代工具已大幅简化了优化 SEC 条件、表征和定量聚集体以及在日常使用中配置最佳技术的工作流程。
本应用简报展示了一套用于聚集体研究的完整工作流程解决方案,其能够:
• 从四种简单的储备液中自动混合指定列表中的液相色谱缓冲液,并使用安捷伦缓冲液顾问软件和高分离度生物惰性四元液相色谱泵实时调节 pH 和缓冲液浓度
• 利用动态光散射检测技术测量高阶蛋白质聚集体,补充紫外检测以将高灵敏度扩展至宽质
量范围
• 利用光散射检测表征聚集蛋白质和单体蛋白质的绝对分子量和流体动力学半径
在该分析中,我们使用 Agilent AdvanceBio SEC 15 cm 色谱柱为快速筛查提供快速分离。值得注意的是,AdvanceBio SEC 色谱柱提供更长(和更短)的类型,因此在可能需要更高分离度的情况下,该方法可轻松适用于 30 cm 色谱柱或甚至更多色谱柱。本研究中的单克隆抗体样品包括市售利妥昔单抗和市售利妥昔单抗生物仿制药。
结论
包含全生物惰性流路的 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色谱系统与安捷伦缓冲液顾问软件相结合,提供了对用于蛋白质聚集体定量分析的体积排阻色谱进行方法优化的简单方法。在较短的 Agilent AdvanceBio SEC 300Å 15 cm 色谱柱下能够实现更快速的分离,大大提高了通量并缩短了筛选各种分析条件所需的时间。为获得更高的分离度和准确度,可使用更长的 30 cm 色谱柱。AdvanceBio SEC 色谱柱表现出更多优势,例如非特异性结合。Bio-MDS 多检测器套装与 Bio-SEC 软件可用于揭示通过任何其他方法难以检测的低浓度高分子量聚集体。最后,Bio-MDS 可用于测定蛋白质分子量或与 DLS 检测结合测定流体动力学半径信息。该技术组合包括完整的工作流程解决方案,可快速优化 SEC 条件,准确定量整个分子量范围内的聚集体,并表征单克隆抗体在相关缓冲液条件下的聚集动力学。
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