利用 UHPLC 联用三重四极杆质谱仪同时高灵敏度测定酒中的多种真菌毒素

    摘要

    本文开发了一种可同时测定葡萄酒中八种真菌毒素的方法，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1 和G2、展青霉素、呕吐毒素、赭曲霉毒素A 以及玉米赤霉烯酮。在氯化钠和硫酸镁存在的条件下，采用乙腈对样品进行初步提取。采用旋转蒸发法对得到的提取物进行浓缩，然后进行复溶，再利用超高效液相色谱(UHPLC) 三重四极杆质谱多反应模式(MRM)检测。结果表明在红葡萄酒和白葡萄酒中八种真菌毒素的检测限(LOD) 分别在0.050 至3.3 μg/L 和0.030 至8.0 μg/L 范围内，定量限(LOQ) 分别介于0.15 至2.5 μg/L 和0.10至25 μg/L 范围内。对于全部八种真菌毒素，在选定的两个数量级的基质匹配校准范围内线性响应良好，线性回归系数为0.995 或更高。对于所测定的两个加标水平，回收率介于59.6–132.4%，精密度(RSD) 介于1.2–21.1% (n = 6)。其中，大部分加标样品的回收率为70%–120%，RSD 小于10%。本文开发的方法快速、准确、灵敏，可用于葡萄酒中多种真菌毒素的高通量常规筛查，并可能扩展到其它发酵酒类样品的应用中。

    前言

    真菌毒素是由各种真菌在适宜的气候条件下自我复制而生成的一系列次级代谢产物。已见诸报道的真菌毒素有300 余种。研究表明一些真菌毒素会导致多种不良健康效应，包括抑制免疫系统，诱发癌症及畸形，干扰生长发育，等等[1,2]。用于酿酒的农产品（例如葡萄）在生长、储存和加工过程中易感染真菌，进而受到真菌毒素的污染。

    赭曲霉毒素A (OTA) 是葡萄酒中最常见的一种真菌毒素[3-5]。欧盟(EU) 规定酒中OTA 的最高限量为2 μg/L。事实上许多其它的真菌毒素也可能存在于酿造完成的酒中，例如黄曲霉毒素（B1、B2、G1 和G2），呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、展青霉素(PAT) [6,7]。一些国家和国际组织已经规定了大多数原始农产品中这类真菌霉素的最高限量。但是，这些真菌毒素在酒中的限量至今并没有得到太大的关注。

    不同于其它食物商品，酒是一种特殊的饮品，其主要成分为酒精。与真菌毒素自身对人体健康的影响相比，在饮酒的同时摄入真菌毒素可能会加重影响。一篇近期的报道指出，小鼠同时摄入黄曲霉毒素B1（一种致癌的真菌毒素）及乙醇表现出加合效应，会显著加重对其肝脏的氧化损伤[8]。与其它食品相比，人体对酒中某些真菌毒素的耐受性可能较低，因此，需要建立一种灵敏可靠的方法对酒中的潜在真菌毒素进行常规筛查，以确保消费者的安全。对酒中的潜在真菌毒素进行常规筛查以确保安全性。高效液相色谱电喷雾串联质谱法(HPLC-ESI-MS/MS)，结合多种预提取技术，已广泛应用于检测玉米、饲料、牛奶及草药等基质中的真菌毒素[9-14]。但是，极少有报道关注葡萄酒中的多种真菌毒素[15]。本应用简报基于UHPLC-ESI-MS/MS 技术，展示了一种用于快速有效检测葡萄酒中潜在八种真菌毒素的高通量检测方法。

    结论

    本应用简报开发了一种同时监测红葡萄酒和白葡萄酒基质中八种真菌毒素的高灵敏度方法。采用八倍样品体积的含盐乙腈对样品进行提取，在浓缩后采用多反应监测模式进行UHPLC-ESI-MS/MS分析。通过免去净化步骤，并利用时间分段法在一次高效液相色谱分析中，于正、负离子模式下同时检测真菌毒素，显著改善了方法通量。该方法能够可靠地检测红葡萄酒和白葡萄酒基质中的八种真菌毒素，回收率和精密度皆满足要求。该方法具有高灵敏度，可在大大低于现行的关于葡萄酒、酿酒原材料或其它食品中的最高限量的水平下检测八种真菌毒素，因此有望应用于葡萄酒产品中真菌毒素的常规监测。