传输效率高达85%(Talanta): SC-ICPMS和LA-ICP-MS测定和定位ARPE-19

上海凯来

2024/02/19 09:58

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所有生物系统中的细胞群都以其异质性而闻名。此外，基因组、转录组和蛋白质组细胞间的变异可能是不同病理的起源。为了评估细胞变异性，对目标群体中的单个细胞进行定量分析是目前一个关键的研究领域。

在过去的几年里，SC-ICP-MS已被用于分析单个细胞中的内源性元素，以更好地了解它们的生物学功能，研究金属纳米颗粒(NPs)的细胞内化，以及评估金属药物的摄取。此外，使用金属标记抗体可以确定细胞内的特定生物分子。SC-ICP-MS可用于细胞培养物中目标生物分子的高通量定量测定，但无法提供每个细胞内生物分子的分布情况。这可以通过使用LA-ICP-MS直接对细胞取样来克服。LA-ICP-MS是元素和同位素分析的强大工具，提供了从生物组织切片和细胞获得高分辨率图像的能力。

摘要

本文首次使用SC-ICP-MS和LA-ICP-MS作为互补技术来全面研究单个细胞中的靶蛋白：SC-ICP-MS检测蛋白，LA-ICP-MS定位亚细胞水平。为了实现显著扩增以检测细胞中低浓度水平的蛋白质，使用IrNCs标记的免疫探针(每个免疫探针平均1760个Ir原子)。本文顺序测定了在同一体外模型（人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19））表达的两种蛋白质(载脂蛋白E（APOE）和claudin-1)，采用SC-ICP-MS和LA-ICP-MS对经葡萄糖(GL)氧化应激处理的培养细胞和未经处理的对照细胞进行分析。本文采用microFAST SC 单细胞/单颗粒样品引入系统进行SC-ICP-MS分析。该系统用于ARPE-19细胞传输时的传输效率为85±9%（使用PtNPs标准时为91±5%）。在细胞悬液中使用特异性IrNC免疫探针(SC-ICP-MS)进行适当的免疫细胞化学处理后，获得单个ARPE-19细胞中APOE和claudin-1的质量。SC-ICP-MS每个细胞的平均检出限为0.02 fg的APOE和3 ag的claudin-1。SC-ICP-MS获得的样品分析结果用商用ELISA试剂盒验证。LA-ICP-MS揭示了两种靶蛋白在单个细胞(固定在腔壁上)中的分布。IrNCs免疫探针提供的高扩增率允许在单个ARPE-19细胞中鉴定APOE和claudin-1。采用imageGEO激光剥蚀系统，2 × 2 μm的激光光斑获得高分辨率图像。

结论

首先，研究对SC-ICP-MS分析中的细胞进样浓度进行了优化，如图1所示，在使用microFAST SC 单细胞/单颗粒样品引入系统时，当细胞浓度为1 × 105 cells·mL^-1时，检测到的事件数量足够大，可以获得具有代表性的数据，具有多个事件的可能性最小，信号背景比最大。因此，后续SC-ICP-MS分析中选择的细胞浓度为1 × 10⁵ cells·mL^-1。

图1 SC-ICP-MS 分析中ARPE-19细胞浓度优化

随后，对比了不同抗体浓度和清洗次数对SC-ICP-MS检测到事件数的影响（图2），结果表明，在抗体浓度为10 μg·mL^-1、清洗2次的条件下，可确保有过量的抗体来识别所有蛋白质，能有效去除过量的免疫探针，并且不会损失过多细胞。

图2 不同抗体浓度和清洗次数对单个ARPE-19细胞中Ir免疫探针分析的影响

使用上述优化条件对分别葡萄糖（GL）氧化应激处理和对照组（CT）细胞中的APOE和claudin-1蛋白进行了SC-ICP-MS分析，其质量频率直方图如图3所示。结果显示，GL处理中约30%的细胞受到高血糖诱导氧化应激的显著影响，这些细胞中APOE的质量在0 ~ 0.05 fg/cells之间。CT组中38%细胞的claudin-1质量在5-10 ag/cell之间，而GL细胞只有21%在这个范围内。GL处理也增加了claudin-1质量的细胞百分比，在50-500 ag/cell范围内。

图3 CT和GL处理下APOE和claudin-1蛋白质量频直方图

最后，本研究将单个ARPE-19细胞固定在孔室中培养，并通过LA-ICP-MS评估目标蛋白在单个细胞中的分布。采用imageGEO激光剥蚀系统，2 × 2 μm方形激光光斑(表1)，优化实验条件，兼顾高空间分辨率和灵敏度。激光能量密度设置尽可能低，但仍会导致整个细胞体积的消融。所有分析的ARPE-19细胞具有相似的厚度，并且在整个成像过程中调整了相同的扫描焦点。图4A和B显示了APOE蛋白在单个CT和GL处理的ARPE-19细胞中的分布，图5A和B显示了claudin-1蛋白在单个CT和GL处理的ARPE-19细胞中的分布。LA-ICP-MS证实，在相同的细胞群中，蛋白质分布在细胞间也是不同的。