最佳选择是它！ICP-MS测定氧化应激条件下体外人类视网膜色素上皮细胞模型分泌的细胞外囊泡中的内源性

上海凯来

2024/02/19 09:45

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最近的研究发现癌症和神经退行性疾病与氧化应激（OS）和代谢失衡有关^[1][2]。当细胞受到氧化应激（OS）或炎症等应激刺激时，细胞的分泌活动会发生改变^[3][4]。人视网膜色素上皮细胞(HRPEsv)含有多种抗氧化剂，其活性需要金属，包括铁、铜和锌。因此，本文进行了人视网膜色素上皮细胞（HRPEsv）中内源性铁、铜和锌的分析，研究其对抗氧化过程的影响。

摘要

本文通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定了人视网膜色素上皮细胞（HRPEsv）体外模型分泌的外泌体（<200 nm 细胞外囊泡）中的内源性铁、铜和锌。通过添加偶氮二异丁脒盐酸盐（AAPH）进行氧化应激（OS）与非氧化应激实验对比，评估两组细胞中金属成分可能存在的差异。为进行 ICP-MS 分析，测试了三种样品引入系统：

(i) MicroMist DC Nebulizer (Glass Expansion)；

(ii) Single Cell sample introduction system (Glass Expansion) including a MicroMist HE U-Series nebulizer and a single cell chamber；

(iii) microFAST Single Cell system (Elemental Scientific, Inc.) including a CytoNeb nebulizer, a CytoSpray chamber and one-piece ICP-MS torch.

研究发现microFAST SC的引入方式最合适。

研究了从细胞培养基中分离外泌体的两种方案，分别基于差速离心法和聚合物试剂沉淀法。与差速离心法相比，聚合物沉淀法纯化的外泌体颗粒浓度更高，但聚合物沉淀法对铁、铜和锌空白的贡献更大。

因此，考虑到 HRPEsv 细胞系外泌体中被评估的内源元素浓度较低，放弃了聚合物沉淀法。在对照组和OS组的 HRPEsv 细胞样品中的金属含量实验中，铁和铜的结果在统计学上相似，Zn在OS组有明显升高（对照组和 OS 组分别为 11μg L-1和34μg L-1），这表明 OS 诱导的分泌活动会导致Zn消耗，是HRPEsv 细胞系抗氧化能力的基础。

科普

1. 外泌体：外泌体存在于血液、尿液、脑脊液、唾液、乳汁、精液、腹腔积液、关节滑液等生物体液中。它携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，因此通过外泌体的转移能够实现细胞间的物质运输和信息传递（应用：药物输送、疾病的生物标志物）。

2. 氧化应激：是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。

通过比较两种分离细胞器的方法（差速离心与聚合物沉淀法），发现差速离心的空白相对更低，考虑到本文中的待分析元素含量低，因此选择了差速离心法。

2. 为使外泌体再悬浮以便于测试所必须引入的缓冲液会带来较高的空白，通过比较不同的缓冲液及纯化的缓冲液，最终确定选用纯化后的PBS本底更低。

本实验为进一步优化引入方式，对比了三种引入方式检测限，发现microFAST SC的引入检测限最低。

AAPH刺激后的氧化应激结果Fe、Cu没有显著差异，Zn在受刺激后明显升高，说明Zn的分泌与激活抗氧化机制相关，Zn失衡是造成眼部疾病的关键因素。

（备注：中文译本仅供参考,以英文原版为准）

ESI microFAST SC单细胞/单颗粒样品系统，是一套专为单细胞和纳米颗粒设计的ICPMS进样系统。该系统由microFAST 单细胞自动进样器和Single Cell Sample Introduction Kit 单细胞/单颗粒样品引入套装（CytoNeb-单细胞雾化器和CytoSpray-单细胞雾化室）组成，达到温和的、可控的雾化条件，以免破坏或溶解细胞，实现单细胞/纳米颗粒的高效进样。

文献参考

[1] M.D. Jelic, A.D. Mandic, S.M. Maricic, B.U. Srdjenovic, Oxidative stress and its role in cancer, J. Cancer Res. Therapeut. 17 (2021) 22‒28, https://doi.org/10.4103/ jcrt.JCRT_862_16.

[2] A. Singh, R. Kukreti, L. Saso, S. Kukreti, Oxidative stress: a key modulator in neurodegenerative diseases, Molecules 24 (8) (2019) 1583, https://doi.org/ 10.3390/molecules24081583.

[3] M. Harmati, E. Gyukity-Sebestyen, G. Dobra, L. Janovak, I. Dekany, O. Saydam, E. Hunyadi-Gulyas, I. Nagy, A. Farkas, T. Pankotai, Z. Ujfaludi, P. Horvath, F. Piccinini, M. Kovacs, T. Biro, K. Buzas, Small extracellular vesicles convey the stress-induced adaptive responses of melanoma cells, Sci. Rep. 9 (2019), 15329, https://doi.org/10.1038/s41598-019-51778-6.

[4] Y. Gao, X. Huang, H. Lin, M. Zhao, W. Liu, W. Li, L. Han, Q. Ma, C. Dong, Y. Li, Y. Hu, F. Jin, Adipose mesenchymal stem cell-derived antioxidative extracellular vesicles exhibit anti-oxidative stress and immunomodulatory effects under PM2.5 exposure, Toxicology 447 (2021), 152627, https://doi.org/10.1016/j. tox.2020.152627.

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