人血清中15种抗癫痫药物检测方案(液质联用仪)

应用简报 Agilent临床研究 Trusted Answers 使用 Agilent Ultivo LC/TQ分析人血清中的抗癫痫药物 Jennifer Hitchcock、Lauren Frick²、Peter Stone1、 Vaughn Miller 安捷伦科技有限公司 Santa Clara， CA ”安捷伦科技有限公司 在临床研究中分析抗癫痫药物可能具有挑战性，因为这些药物可能以迥然不同的浓度水平存在于人血清中。因此，高质量的检测方法必须能够同时分析多个浓度数量级下的多种化合物。在 Agilent Ultivo 三重四极杆 LC/MS (LC/TQ) 上测试了一种用于定量分析人血清中15种抗癫痫药物的高灵敏度、高特异性分析方法。该方法通过一种简单的蛋白质沉淀/稀释方案配制样品。可在较宽的动态范围内定量分析物，准确度和重现性指标以及R²值均处于可接受范围内。 Lexington， MA 长期以来，液相色谱-串联质谱联用系统(LC/MS/MS) 已经在分析研究实验室中表现出重要的价值，因为它在单次进样分析多种化合物时表现出优异的分析特异性和灵敏度。尽管存在这种便利，但美中不足是此类仪器体积过于庞大，对当前日益宝贵的实验室空间形成了重要挑战，许多大型临床研究实验室有时不得不转而寻求其他创新性的解决方案。在保持传统尺寸质谱仪功能的同时最大程度减小仪器体积，可以为此类实验室提供一种绝佳的解决方案。在此背景下，我们使用一组抗癫痫药物的人血清样品对安捷伦微型 Ultivo LC/TQ的分析能力进行了评估。将该组样品的分析结果与采用大型 Agilent 6470 LC/TQMS分析得到的相同样品组的结果进行比较。该分析组中的化合物包括：乙酰瑞替加滨、卡马西平-10，11-环氧化物、卡马西平、10，11-二氢-10-羟基卡平西平、非氨酯、加巴喷丁、拉科酰胺、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡西平、普瑞巴林、瑞替加滨、卢非酰胺、噻加宾和氨己烯酸。分析方法测试了仪器同时检测处于多个数量级浓度范围内的化合物的能力，各种分析物的校准浓度范围为 0.59 ng/mL 至20000 ng/mL。高浓度范围为 0.15 pg/mL 至20 pg/mL. 通过将药物标准品加标到空白人血清中配制样品。为配制待分析的样品和对照品，执行简单的蛋白质沉淀方案，然后用水稀释以降低样品的有机组分含量。进样周期短于10分钟，并对15种目标化合物中每种化合物的两个离子对进行监测。该分析方法也包括用于检测磷脂的离子对，以验证由这些内源性分子带来的任何极小的干扰或抑制。 校准曲线准确度在最低校准浓度下处于预期浓度的±20%以内，且所有浓度下的重现性均可接受， CV小于 15%。R²值均高于0.994，三分之二的化合物在整个浓度范围内表现出线性响应，而其余三分之一的化合物需要进行二次拟合。 液相色谱配置和参数 表1.UHPLC配置和设置 参数 值 仪器 Agilent 1290 Infinity Ⅱ高速泵 (G7120A) Agilent 1290 Infinity 自动进样器(G4226A) Agilent 1290 Infinity 自动进样器温控 (G1330B) Agilent 1290 Infinity ll 高容量柱温箱(G7116B) 进样针清洗 100%甲醇 自动进样器温度 4°C 进样量 4pL 保护柱 Agilent Poroshell 120 EC-C18保护柱， 2.1×5 mm， 2.7 pm(部件号821725-911) 分析柱 Agilent Poroshell 120 EC-C18 液相色谱柱，2.1×100mm，2.7pm(部件号695775-902) 柱温 50°℃ 流动相A 2mM乙酸铵水溶液 流动相B 2mM乙酸铵甲醇溶液 流速 0.4 mL/min 梯度 时间 (min) %B 0.01.05.06.26.37.5 7.51 10105060959510 停止时间 8分钟 后运行时间 1分钟 三重四极杆质谱仪配置和参数 表2.质谱仪仪器配置和离子源设置 参数 值 仪器 Agilent Ultivo 三重四极杆质谱仪 MS/MS模式 动态 MRM 离子模式 正离子 干燥气温度 350°℃ 干燥气流速 12 L/min 雾化器压力 50psi 鞘气温度 350℃ 鞘气流速 11 L/min 喷嘴电压 0V 正离子化的毛细管电压 3500V 正离子化的 Delta EMV 0V MS1/MS2分辨率 0.7/0.7 Unit 驻留时间 可变 分析物和内标的 MS/MS 化合物信息 表3.动态MRM 模式下的详细 MRM 设置 用于基质匹配校准品的人血清购自Golden West Biologicals(Temecula， CA)。标准品和内标购自 Sigma-Aldrich (St. Louis，MO) 和 Cerilliant Corporation (Round Rock， TX)。样品前处理和液相色谱溶剂购自 Sigma-Aldrich (St. Louis， MO)和Honeywell Riedel-de Haen (Seelze， Germany)。 样品前处理 将 15种化合物的药物标准品加标到空白人血清中，得到高浓度样品。用空白血清连续稀释，得到8个较低浓度的样品。将每个样品与内标溶液混合，并用甲醇通过蛋白质沉淀进行提取。对样品进行涡旋混合和离心，并用水将一份上清液稀释10倍，然后将其引入液相色谱系统中。 采集数据并用 Agilent MassHunter 软件包 B.08.00 版对6470LC/TQ MS 采集的数据进行分析，或用C.01.00版对 Ultivo 采集的数据进行分析。在两套仪器上利用 Agilent MassHunterAcquisition Optimizer 软件获得 MS/MS 离子对，在进样分析各种化合物或内标的纯溶液(浓度为1000 ng/mL， 在流动注射模式下进样量为2pL)时确定最佳的母离子和子离子、碎裂电压和碰撞能量。 线性 某些单独分析物的校准浓度范围为 0.59 ng/mL 至20000 ng/mL。其他分析物浓度范围为 0.15 ug/mL 至20 ug/mL。所有分析物的R²值均高于0.994，其中10种化合物在整个浓度范围内表现出线性响应，且5种化合物需要二次拟合以覆盖整个浓度范围。 表 4. 对 Agilent Ultivo TQ 和 Agilent 6470 TQ 的结果比较汇总数据包括信噪比(S/N)、计算得到的柱上LOQ、相关系数和校准曲线拟合结果。数据由校准标样1计算得出，除带有*或**标记的浓度以外，这些浓度分别使用校准标样3和2计算得出。所有化合物均采用1/x加权的校准曲线 Agilent Ultivo TQ Agilent 6470 TQ 化合物 校准品1(ng/mL) 校准品1S/N 计算得到的柱上LOQ (pg) R2 校准曲线 校准品1(ng/mL) 校准品1S/N 计算得到的柱上LOQ (pg) R2 校准曲线 氨己烯酸 293.11* 3.00 23.44 0.9977 线性 84.14 17.57 6.73 0.9974 线性 普瑞巴林 6.83 4.32 0.55 0.9977 线性 6.84 28.04 0.55 0.9971 线性 加巴喷丁 9.75 58.50 0.78 0.9971 线性 10.63 98.49 0.85 0.9978 线性 左乙拉西坦 40.42 687.31 3.23 0.9997 二次拟合 40.59 1084.66 3.25 0.9997 二次拟合 拉科酰胺 6.92 261.91 0.55 0.9976 线性 7.75 343.6 0.62 0.9989 线性 卢非酰胺 13.88 350.73 1.11 0.9995 二次拟合 30.50** 856.41 2.44 0.9948 二次拟合 非氨酯 26.44 67.59 2.11 0.9990 二次拟合 24.16 824.09 1.93 0.9977 二次拟合 拉莫三嗪 7.07 3.81 0.57 0.9937 线性 8.12 224.01 0.65 0.9993 线性 10，11-二氢-10-羟基卡马西平 13.69 372.73 1.10 0.9993 二次拟合 12.88 1020.54 1.03 0.9986 二次拟合 卡马西平-10，11-环氧化物 9.92 632.08 0.79 0.9992 线性 9.98 318.23 0.80 0.9995 线性 N-乙酰瑞替加滨 1.14 5.04 0.09 0.9987 二次拟合 1.20 28.44 0.10 0.9994 二次拟合 奥卡西平 2.02 20.68 0.16 0.9991 线性 1.98 70.23 0.16 0.9982 线性 卡马西平 16.37 140.18 1.31 0.9969 线性 16.34 782.22 1.31 0.9963 线性 瑞替加滨 1.81 4.27 0.14 0.9944 线性 2.14 4.44 0.17 0.9960 线性 噻加宾 0.61 126.86 0.05 0.9973 线性 0.59 28.77 0.05 0.9986 线性 准确度和重现性 15种化合物中每种化合物的校准曲线在最低校准浓度表现出预期浓度±20%以内的准确度，在所有其他浓度下的重现性表现出小于15%的CV。表5和表6分别示出 Ultivo 和6470仪器准确度和重现性之间的详细对比。 图2.分散在整个色谱图中的化合物的示例性校准曲线。所有校准曲线均采用1/x的加权因子 表 5.利用 Agilent Ultivo TQ 分析得到的曲线准确度和重现性(n=3) 左乙拉西坦 奥卡西平 普瑞巴林 环氧化物 瑞替加滨 卢非酰胺 噻加宾 氨己烯酸 拉莫三嗪 浓度级别 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 1 103.5 1.5 103.2 5.5 87.4 11.8 92.5 7.4 88.8 1.8 103.9 13.5 88.6 2.4 2 99.6 1.4 97.2 1.3 95.9 8.8 94.5 9.8 101.2 2.2 92.4 6.2 93.9 1.4 99.9 6.3 3 98.7 1.6 95.9 1.1 99.8 0.3 98.2 1.2 103.3 2.4 98.1 13.1 104.2 8.5 92.4 1.9 4 100.6 1.2 98.5 3.5 102.4 1.4 104.3 6.9 106.0 0.2 98.4 5.8 100.6 4.7 101.9 7.5 5 96.7 0.8 101.0 3.2 102.9 1.1 107.2 3.8 102.2 1.9 98.7 5.6 104.0 8.2 101.3 7.0 6 101.8 1.7 104.0 2.2 108.7 0.8 105.4 5.9 101.2 0.7 107.9 1.8 97.7 5.9 102.1 1.4 7 97.5 1.0 100.1 0.5 102.4 1.2 96.1 3.3 96.7 1.0 99.6 2.6 93.3 1.3 100.7 2.4 8 102.0 1.8 101.0 1.0 104.5 1.1 104.2 3.0 100.5 2.3 103.3 3.5 97.1 1.6 99.9 0.8 9 99.6 1.5 99.0 1.6 95.9 1.4 97.7 4.0 100.1 1.2 97.7 5.7 103.1 2.3 99.5 1.9 表6.利用 Agilent 6470 TQ 分析得到的曲线的准确度和重现性(n=3) 卡马西平-10，11- 羟基卡马西平 左乙拉西坦 奥卡西平 普瑞巴林 环氧化物 瑞替加滨 卢非酰胺 噻加宾 氨己烯酸 拉莫三嗪 浓度级别 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 平均值 CV 1 103.9 1.3 101.2 2.7 87.6 4.7 109.5 0.7 77.3 2.5 100.8 2.6 119.7 14.4 103.9 6.3 2 97.6 1.3 97.0 5.8 91.8 0.8 110.4 12.5 97.6 0.5 97.8 3.0 105.3 12.1 96.5 6.8 3 98.9 0.3 99.9 5.0 100.0 2.7 87.6 2.7 120.4 2.2 96.8 4.0 96.8 3.2 99.6 4.5 4 100.3 1.4 98.6 2.5 104.4 2.6 86.4 8.9 122.2 3.9 102.7 2.4 95.1 6.7 97.1 2.2 5 98.2 0.4 98.3 1.8 103.0 1.4 99.2 14.9 111.6 3.5 97.8 0.8 92.5 6.3 98.5 3.2 6 102.5 1.4 103.3 1.7 109.7 2.0 101.0 6.6 103.0 3.3 102.5 1.1 96.5 0.1 13.4 1.4 7 97.2 1.2 98.5 1.9 103.0 1.5 97.8 6.7 94.9 2.1 98.9 0.4 92.3 3.8 100.0 1.6 8 101.6 0.9 106.0 2.0 105.2 1.4 104.1 5.5 94.6 2.4 105.3 0.8 97.6 0.7 102.7 2.2 9 99.7 1.7 97.1 1.9 95.2 2.1 98.8 5.6 103.6 3.0 97.4 0.7 104.1 1.2 98.4 1.2 安捷伦微型 Ultivo LC/TQ 提供了与 Agilent 6470 LC/TQ 相当的结果。相同分析条件下的平行比较结果表明，减小仪器的尺寸并不影响任何分析灵敏度或动态范围。 未来的工作需要进一步评估潜在的基质干扰，以应用于更多的抗癫痫药物，从而建立更全面或适用范围更广的分析研究方法。 ( 1 Frick， L. E.； M iller， V. P. Simultaneous LC/MS/MS Quantitation of 20 Anti-epileptic Drugs in Human Serum.Poster presented at MSACL， January 2017， 23-26， ) Palm Springs， CA 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2018 摘要在临床研究中分析抗癫痫药物可能具有挑战性，因为这些药物可能以迥然不同的浓度水平存在于人血清中。因此，高质量的检测方法必须能够同时分析多个浓度数量级下的多种化合物。在 Agilent Ultivo 三重四极杆 LC/MS (LC/TQ) 上测试了一种用于定量分析人血清中 15 种抗癫痫药物的高灵敏度、高特异性分析方法。该方法通过一种简单的蛋白质沉淀/稀释方案配制样品。可在较宽的动态范围内定量分析物，准确度和重现性指标以及 R2 值均处于可接受范围内。前言长期以来，液相色谱-串联质谱联用系统 (LC/MS/MS) 已经在分析研究实验室中表现出重要的价值，因为它在单次进样分析多种化合物时表现出优异的分析特异性和灵敏度。尽管存在这种便利，但美中不足是此类仪器体积过于庞大，对当前日益宝贵的实验室空间形成了重要挑战，许多大型临床研究实验室有时不得不转而寻求其他创新性的解决方案。在保持传统尺寸质谱仪功能的同时最大程度减小仪器体积，可以为此类实验室提供一种绝佳的解决方案。在此背景下，我们使用一组抗癫痫药物的人血清样品对安捷伦微型 Ultivo LC/TQ 的分析能力进行了评估。将该组样品的分析结果与采用大型 Agilent 6470 LC/TQ MS 分析得到的相同样品组的结果进行比较。该分析组中的化合物包括：乙酰瑞替加滨、卡马西平-10,11-环氧化物、卡马西平、10,11-二氢-10-羟基卡马西平、非氨酯、加巴喷丁、拉科酰胺、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡西平、普瑞巴林、瑞替加滨、卢非酰胺、噻加宾和氨己烯酸。分析方法测试了仪器同时检测处于多个数量级浓度范围内的化合物的能力，各种分析物的校准浓度范围为 0.59 ng/mL 至 20000 ng/mL。高浓度范围为 0.15 μg/mL 至 20 μg/mL。通过将药物标准品加标到空白人血清中配制样品。为配制待分析的样品和对照品，执行简单的蛋白质沉淀方案，然后用水稀释以降低样品的有机组分含量。进样周期短于 10 分钟，并对 15 种目标化合物中每种化合物的两个离子对进行监测。该分析方法也包括用于检测磷脂的离子对，以验证由这些内源性分子带来的任何极小的干扰或抑制。校准曲线准确度在最低校准浓度下处于预期浓度的 ±20% 以内，且所有浓度下的重现性均可接受，CV 小于 15%。R2 值均高于 0.994，三分之二的化合物在整个浓度范围内表现出线性响应，而其余三分之一的化合物需要进行二次拟合。结论安捷伦微型 Ultivo LC/TQ 提供了与 Agilent 6470 LC/TQ 相当的结果。相同分析条件下的平行比较结果表明，减小仪器的尺寸并不影响任何分析灵敏度或动态范围。未来的工作需要进一步评估潜在的基质干扰，以应用于更多的抗癫痫药物，从而建立更全面或适用范围更广的分析研究方法。