食品与饲料中二恶英检测方案(气质联用仪)

2 样品制备 赛默飞世尔科技(中国)有限公司免费服务热线：8008105118 400 6505118(支持手机用户)客服邮箱： sales.china@thermofisher.com Cristian Cojocariu， Manuela Abalos， Esteban Abad Holgadoand Paul Silcock' 'Thermo Fisher Scientific， Cheshire， UK；Spanish Council for Scientific Research (CSIC)，Institute of Environmental Assessment and Water Research， Barcelona， Spain. 关键词 二恶英，食品与饲料， GC-MS/MS， 定量， TargetQuan， 同位素稀释法 前言 二恶英(PCDD/Fs)是包括多氯二苯并二恶英(PCDDs)和多氯二苯并呋喃(PCDFs) 在内的一类剧毒有机化合物，主要通过垃圾燃烧或作为生产有机氯农药等特定化学物质的副产物而产生。二恶英可进入食物链，并长期存留从而产生生物累积。人类食用受污染食物是二恶英的主要暴露途径。美国环境保护署认定即使仅暴露于背景值水平的二恶英，仍可能使人类罹患癌症。因此，精确检测并定量环境中，尤其是食品和动物饲料中的二恶英至关重要。 欧盟立法通过气相色谱-高分辨质谱联用(GC-HRMS)对污染样本中的二恶英进行确证和定量的方法被认为是此类检测的“金标准”。随着近年来气相-三重四极杆质谱联用技术(GC-MS/MS)的不断突破， GC-MS/MS 已可实现兼顾高灵敏度和高选择性。上述进展使得 GC-MS/MS 成为控制食品和饲料中二恶英最高含量水平的又一有力工具。4 根据即将生效的欧盟新法规中规定，除了之前法规中有关GC-HRMS方法的标准外1.3，使用 GC-MS/MS 技术确证二恶英时，要求仪器必须满足下列性能指标：‘ 1.每个四极杆的分辨率都不得低于单位质量分辨率(单位质量分辨率定义为能够区分相差一个质量单位的两个质谱峰的最低分辨率)。 2.对于所有标记或未标记的分析物质的检测均需有两个特征母离子，每个母离子对应特定碎片子离子。 3.实测离子对相对离子强度与理论值偏差不得超过15%(校正标准物质平均值)，以此确认串联质谱状态稳定，尤其是每个分析物质裂解过程中的碰撞能量和碰撞气体压力。 本文评价了 Thermo Scientific TM TSQ 8000 TM Evo 三重四极杆GC-MS/MS 用于分析二恶英类化合物的性能表现。为此，实验中采用标准溶液及食品、饲料样本来评估仪器性能是否符合新的二恶英测试指标要求。同时，比较了 TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 与 GC-HRMS 测试相同食品、饲料提取物的测试结果。 仪器方法设置 ( 应用 TSQ 8000 Evo 三重四极杆串联质谱仪搭配 Thermo ScientificTM TRACETM 1310气相色谱仪完成标准样品和基质样品中二恶英的检测分析。进样采用 Thermo ScientificTMTriPlusTM RSH 自动进样器，并通过 Thermo ScientificTMTraceGOLD TG-5SilMS 毛细管柱(60mx0.25 mml.D.×0.25 um film)实现化合物分离。其他仪器测试参数详见表2。 ) 进样体积(uL)： 2 衬垫： SSL single taper (货号：453A2342) 进样口温度(℃)： 260 进样模式： 不分流 载气及流速(mL/min)： 氦气，1.2 程序升温设置 温度1(℃)： 100 保持时间(min)： 2 温度2(℃)： 250 升温速度(℃/min)： 25 温度3(℃)： 285 升温速度(℃/min)： 2.5 温度4(℃)： 330 升温速度(℃/min)： 10 保持时间(min)： 5 依据即将生效的欧盟对二恶英检测的指标要求，测试中每个四极杆的分辨率均设置为单位分辨率(表2)。 表2.质谱参数设置 TSQ 8000 Evo 质谱参数 传输线温度(℃)： 280 离子化方式： EI 离子源温度(℃)： 300 电离能量(eV)： 40 采集模式： SRM Q2气体压力(氩气)(psi)： 60 碰撞能量(eV)： 见表3 Q1峰宽(Da)： 0.7 Q3峰宽(Da)： 0.7 TSQ 8000 Evo 通过采用电子电离源(EI)电离，在串联质谱模式下工作。数据采集过程中，根据欧盟针对二恶英GC-MS/MS 检测的指标要求，每个化合物分别进行两个离子对的选择性反应检测(SRM)。数据通过智能定时扫描(timed-SRM) 模式确保每个通道的离子流色谱峰不少于12个扫描点。每对离子对及其碰撞能量的优化均由软件中的全自动 SRM 离子对优化(AutoSRM)功能自动优化完成，具体结果见表3。数据处理应用 Thermo ScientificTMTargetQuan 3.1软件完成，该软件专为日常环境中持久性有机污染物(POPs)常规定量分析而设计，可处理MS、MS/MS以及 HRMS 数据。 表3.天然及1C标记的二恶英类化合物的离子反应参数及碰撞能量 天然及1C标记的二恶英类化合物均来自 WellingtonLaboratories Inc.TM。以下食品及饲料提取样本由西班牙国家研究委员会( CSIC)下属环境评估与水质研究所提供：三份干燥鱼类样本(之前曾用于实验室内部其他研究)，一份饲料样本(内部标准物质)及一份奶粉样本(认证标准物质)。饲料基质样本的提取和净化通过 PowerPrepTM 固相萃取系统完成，奶粉和鱼样本则通过多层硅胶、碱性氧化铝柱以及活性炭柱依次手动过滤完成。 数据处理 原始数据通过 TargetQuan 软件完成处理过程，该软件可使用同位素稀释法对持久性有机污染物(POPs) 进行分析。软件基于相对响应因子(或平均响应因子)，结合毒性当量因子(TEFs) 自动计算出毒性当量(TEQs) 并得出总毒性当量。 化合物 图1.与分段式 SRM 相比， timed-SRM 模式对灵敏度提高比率(%)。以上数据通过比较每个二恶英类化合物的峰高(每秒计数)而得。 Timed-SRM 是一种完全不同于之前“经典”的分时间段进行方法设置的分析手段，它使目标化合物的数据采集设定于已知化合物色谱保留时间附近的一段特定窗口内，而不是一个较宽的时间分段内。这样，每个目标化合物在分析检测器中的驻留变得高效，极大地提高了仪器灵敏度，降低了方法检测限。此外，通过使用 timed-SRMs 还可分别检测临近出峰的同分异构体，例如六氯代二苯并对二恶英/呋喃类化合物(HxCDD/Fs)。图1为应用 timed-SRM 与分段式 SRM对灵敏度影响的比较。 4 从色谱上实现二恶英类同分异构体的有效分离是以123478-HxCDF 与 123678-HxCDF 两峰之间峰谷高度小于25%为标准的。1本实验中二恶英类化合物的色谱分离通过最低浓度的标准溶液(EPA1613-CLS) 评估。该溶液含 0.1pg/pL TCDD/F、0.5 pg/pL PeCDD/F-HpCDD/F 和1.0pg/uL OCDD/F。所有天然及1℃标记的待测物均检出，且峰形良好(图2)，所有 HxCDF 同分异构体间峰谷高度均不超过 5%。 图2.最低浓度天然二恶英标准样品的色谱分离(括号中的浓度单位为 pg/uL)。每个化合物仅展示一个 SRM 通道(定量离子)。 图 3.经 GC 分离， 123478-HxCDF 与 123678-HxCDF 两峰之间的峰谷高度小于5% 达到期望的检测水平 对于二恶英检测，最重要的一点就是达到期望的灵敏度。作为一个确证的方法，最低定量限(LOQ)应约为最高限量的五分之一。1.3.4通常来说，考察仪器分析二恶英的灵敏度主要考虑最低检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)，而对于磁质谱，上述参数则通过信噪比(S/N)值计算( LOD 信噪比值为3， LOQ信噪比值为10)。 通过 GC-MS/MS 的 MS/MS 模式采集的数据通常没有或只有很低的噪音，因此需要重新考虑 LOD 和 LOQ的计算方法。假如由于技术原因，无法获得可信的信噪比值来计算上述参数，那么计算每个化合物的LOQ 应根据最低浓度点(例如CSL)来计算，同时参考内标(回收率应在60-120%之间)、离子比例丰度以及色谱峰的情况。“所以， LOQ应通过最低浓度标样(CSL)以及三个相应稀释标准溶液的多次重复进样(n=10)测试来确定。 图4.根据二恶英一系列的稀释标准溶液重复进样结果计算的LOQ。数据表明，每个待测物 LOD 浓度的离子比例和响应因子均符合限定要求。 每个化合物的 LOQ计算均考虑了相关自由度的t检验值(99%置信)，各化合物浓度以及%RSD。结果表明，二恶英类化合物的LOD 在 0.01-0.05 pg/uL之间，相当于 CSL 的 1：5 和1：10的稀释液(在此浓度水平，离子比例和响应因子偏差均在±15%以内；C标记的内标化合物回收率在60-120%之间)(图4)。 最终实验结果证明， TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 可对二恶英实现亚飞克级的检测和确证，完全符合新的欧盟规定要求。3 6 线性响应 二恶英的定量主要是基于同位素稀释法和响应因子校正来计算的。其中，所有标准样品的响应因子均通过外标曲线平均而得。1.5平均响应因子%RSD 是通过样品测试序列开始和结尾时测试的两条含六个测试点的标准曲线计算而得。所有结果 %RSD在1.2-8%之间，完全符合 EPA 关于不得大于15%的限定要求5(表4)。 表4.二恶英类化合物的标准曲线线性(每条曲线六个测试点)。表中展示了每个天然二恶英化合物的平均响应因子准确度(%RSD)。所有数据来自测试样本序列开始和结尾时测试的两套标准曲线。 线性/标准曲线 化合物 线性范围 (pg/uL) 平均响应因子 标准差 响应因子 %RSD 2378-TCDF 0.1-40 1.04 0.02 1.9 2378-TCDD 0.1-40 1.12 0.02 2.2 12378-PeCDF 0.5-200 1.01 0.02 1.5 23478-PeCDF 0.5-200 1.03 0.02 1.6 12378-PeCDD 0.5-200 1.08 0.01 1.4 123478-HxCDF 0.5-200 1.03 0.01 1.2 123678-HxCDF 0.5-200 1.02 0.01 1.4 234678-HxCDF 0.5-200 1.06 0.03 3.2 123478-HxCDD 0.5-200 0.96 0.01 1.6 123678-HxCDD 0.5-200 1.21 0.04 3.6 123789-HxCDD 0.5-200 1.21 0.04 3.6 123789-HxCDF 0.5-200 1.36 0.01 0.8 1234678-HpCDF 0.5-200 1.06 0.02 1.7 1234678-HpCDD 0.5-200 1.07 0.02 2.1 1234789-HpCDF 0.5 -200 1.12 0.02 2.2 OCDD 1.0-400 1.54 0.04 2.4 OCDF 1.0-400 1.09 0.03 3.2 峰面积重现性 17种二恶英的峰面积精密度考察是通过对最低浓度标准溶液(CSL)多次重复进样测试(n=16)进行的。结果表明所有化合物的%RSD 值均低于所规定最大15%的限值，其中，偏差最大的为 2378-TCDD(8.3%)，偏差最小的为12378-PeCDD(3.2%)(图5)。 离子比例 样品测试过程中还测定了17种二恶英各自的离子对离子比(IR)，并将测定值与标准物质的离子比例测定值(标准样本CSL-CS4的平均值)做比较。测试结果表明，样本中所有待试物质的 IR与标准物质IR偏差均小于15%，符合欧盟对二恶英测试的规定标准准(图6)。 图5.标准曲线最低浓度点(浓度范围0.1-1.0 pg/pL) 重复进样(n=16)的峰面积重现性。虚线标明最大容许偏差范围为15%。 图6.17种二恶英在样本提取物中的离子比例与标准样品(CSL-CS4) 计算得出的平均离子比 例值比较 图7.2378-TCDD 与其内标"C-2378-TCDD在鱼(a)、饲料(b)和奶粉(c)样本中的提取离子流色谱图。图中所标的为样本中的化合物浓度(pg/g)。 图8.饲料样本中各二恶英类化合物分别通过 TSQ 8000 Evo 和 GC-HRMS测试所得含量(TEQ pg/g) 比较。 图9.奶粉样本中各二恶英类化合物分别通过 TSQ 8000 Evo 和 GC-HRMS测试所得含量(TEQpg/g)比较。 图10.鱼样本中各二恶英类化合物分别通过 TSQ 8000 Evo 和 GC-HRMS 测试所得含量 (TEQpg/g) 比较。 比较 TSQ 8000 Evo 和磁质谱测试数据计算出每个样本中的总二恶英含量值，偏差不超过5%(图11)。每种基质样本中的二恶英最大限值(ML)和处置限值(AL)亦被标出。” Z-Score 结果 为了检查 TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 测试结果的准确性，对所有鱼样本进行了Z-Score 检验(这些样本曾用于实验室内部其他测试)。通过每个样本的公议值(例如总二恶英含量值)、测定值及相应的标准偏差值进行检验计算。检验结果显示，通过 GC-MS/MS 测试的所有鱼样本数据的 Z-Score值均在±2限值以内，平均值为-0.8(图12)。 总二恶英含量(pg TEQ/g) 图11. TSQ 8000 Evo 测试各样本中总二恶英含量值与 GC-HRMS测试值偏差(%)。 图12.鱼样本的 Z-Score 通过将公议TEQ值的±20%作为目标标准偏差值进行计算。 综上所述，本次实验证明 TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 是二恶英常规分析的有力工具，完全符合即将生效的欧盟法规对于二恶英在食品和饲料中的确证要求。 本次测试结果充分展示了 TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 作为一台高灵敏度和高选择性的仪器，可以完全胜任食物和饲料中二恶英的检测和确证工作。 ( TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 搭配 TRACE 1310气相色谱仪和 TargetQuan 3.1数据处理及报告软件可系统化解决复杂样本中的二恶英分析问题。 ) 仪器在测试标准样品和实际样品提取物时均展示出了出色的重现性、线性、灵敏度和选择性。 基质样本中二恶英的 TEQ 计算值与磁质谱一致，充分证明了本仪器系统对于二恶英常规确证分析的可靠性。 ( 参考文献 ) ( 致谢 ) ( 感谢来自 Wellington Laboratories Inc. 的 Brock G. Chittim提供 EPA 1613标准样品。 )