葡萄酒中黄酮类化合物检测方案(液相色谱仪)

2 引言 葡萄酒历史悠久、品味独特、营养丰富，深受人们的喜爱。但对葡萄酒的保健功能研究却法始于1987年雷诺(Renaud)提出的“法国悖论”现象：在20世纪法国人和其他欧洲人都一样吸烟和摄入大量肉类食品，但法国人罹患心脏病和高血压病却明显比其他国家低。通过大量科学研究，发现法国人喜欢饮用葡萄酒，而葡萄酒中含有大量多酚类化合物，如白藜芦醇，而该类化合物具有抗氧化作用，可以延缓机体衰老。再后发现葡萄酒中另一种多酚类-黄酮类化合物，如皮素，具有软化血管、抗凝血作用，可以预防脑血栓、脑出血、急性心脏病.。随着人们对葡萄酒的保健功能不断加深，对其中的功能物质分析也有着更大的需求。由于葡萄酒为葡萄果实在避光和隔氧条件下的发酵产物，其中成分除了含有多酚类化合物，还有其他组分，如糖、氨基酸、有机酸、微生物菌群，组分较复杂，对其中某一特定物质进行分析带来巨大挑战。通常需要将葡萄酒进行不同程度的分离后再进行分析。本文在参考文献23的基础上，采用固相萃取(SPE)纯化葡萄酒样品，然后用反相色谱联合紫外检测分析葡萄酒中白藜芦醇、皮素和山柰酚的含量。 仪器与试剂U3000液相色谱仪，配置高压二元泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器水，乙腈，甲醇、甲酸均为色谱纯；白藜芦醇 (CAS RN： 501-36-0)、檞皮素(CAS RN： 117-39-5)、山柰酚 (CASRN： 520-18-3)对照品(含量：≥98.0%) 色谱条件 色谱柱：Acclaim 120 C18， 4.6×150 mm， 5 pm， PN： 059148柱温：：330℃ 流动相：A：0.1%甲酸水溶液，B：0.1%甲酸-乙腈，流速：： 1.0 ml/min 进样量：10pL 检测波长：UV@360nm 标准品制备 分别称取白藜芦醇、皮素和山柰酚对照品10 mg 并转移至100ml量瓶中，用80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度各为 100 pg/ml混合标准品储备液。密封并于4℃条件下避光保存。 取混合标准品储备液，用50%甲醇制成浓度分别为0.5，1.0，5.0，10， 50 pg/ml 的标准溶液，摇匀，作为线性范围测试溶液。密封并于4℃条件下避光保存。 样品制备 取 PEP固相萃取小柱(60 mg/3ml)， 分别用甲醇6ml，水6ml进行活化。量取2ml 葡萄酒样品转移至活化的小柱上，依次用0.1%甲酸3ml，20%甲醇(含0.1%甲酸)3ml洗脱，弃去洗脱液，再用80%甲醇(含0.1%甲酸)2ml洗脱，收集洗脱液，用微孔(0.22pm)滤膜过滤，备用。 结果与说明 吸附容量考察 在酒样品溶液中加入混合对照品储备液制成最终浓度为10 ug/ml 的加标样品溶液。将该溶液以 0.5ml 为单位体积加入至已活化的萃取小柱上，并分别接收流出液，测定其中三种组分的含量，测试结果见图2 图2中吸附容量变化曲线显示，在上样量小于2ml时，三种组分均保留在小柱上，当上样量超过 2ml时，则有组分开始流出，表明此时已达到最大吸附容量，，为保证组分不损失，上样量不得超过2ml。 洗脱溶剂选择 吸取2ml加标样品溶液加入至已活化的小柱上。依次用如下溶剂(3ml，含0.1%甲酸)进行洗脱：水，10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的甲醇水溶液。以1ml为单位体积收集洗脱液并测定三种组分含量，结果见图3 从洗脱曲线中可以看出，低于20%甲醇溶液无法将目标组分从萃取小柱上进行洗脱，当甲醇浓度升至30%时，目标组分开始洗脱，至浓度增至100%时，所有组分均完全洗脱。实际测试结果显示100%甲醇洗脱液含有较多杂质，会干扰组分测定，而80%甲醇采用2ml即可将三种组分完全洗脱，因此样品前处理程序采用20%甲醇3ml进行洗脱并弃去洗脱液，随后采用80%甲醇2ml进行洗脱并收集洗脱液用于分析。 图2.吸附容量考察 图3.洗脱曲线 专属性分析 分别进样溶剂(20%甲醇)、对照品和80%甲醇洗脱液测试其响应信号，结果见图4 从图中可以看出，空白溶剂对三种组分的分析无干扰，且样品中三种组分均与相邻组分达到基线分离，分析结果无重大偏差。 线性范围考察 取线性范围标准溶液，按照浓度由低到高的顺序依次进样，测定其峰面积，并进行线性回归处理，结果见表1 表1.校准结果 名称 斜率 截距 相关系数 白藜芦醇 5.961 0.5157 0.9986 槲皮素 2.379 0.1400 0.9981 山柰酚 1.296 0.1932 0.9967 结果表明，三种组分的响应值与相对应的浓度系列呈现良好线性关系。 重复性试验 取对照品溶液，连续进样6针，计算保留时间和峰面积RSD%。结果见表2 表2.重复性试验 序号 保留时间(min) 峰面积 1 5.667 10.8629 2 5.672 10.8822 3 5.662 10.8932 4 5.673 10.8625 5 5.666 10.8826 6 5.668 10.8256 RSD% 0.07 0.22 测试结果表明，连续进样6针，保留时间和峰面积的偏差均符合要求，表明该方法重现性良好。 样品测定与加样回收试验 按照实验部分中样品制备方法同时平行制备样品溶液和加标供试液并测定其响应信号。结果见图5和表3、4 图4.专属性考察 图5.加标回收测试(加标样品-黑色，样品-橙色) 表3.加标回收分析结果(n=2) 名称 含量 (ug/ml) 加标量 (ug/ml) 总含量 (ug/ml) 回收率(%) 白藜芦醇 0.6012 5 5.3218 94.4 槲皮素 0.2151 5 5.1252 98.2 山柰酚 0.1245 5 5.1148 99.8 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 白藜芦醇 0.252 0.602 0.522 0.225 0.385 槲皮素 0.122 0.215 0.188 0.126 0.152 山柰酚 0.082 0.125 0.112 0.116 0.091 由于葡萄酒中有着多种多酚类化合物，且白藜芦醇出峰较早，因此相邻峰对白藜芦醇的定量分析干扰较大，导致加标回收测试结果偏差较大。从不同产地的葡萄酒中三种目标组分的含量来看，不同产地的葡萄酒，可能由于葡萄来源、发酵工艺及储藏条件的差异，导致其中的目标成分含量存在较大差别。 通过对方法学的考察，结果表明该方法具有良好的专属性，线性范围，重现性及准确度，1可用于葡萄酒中白藜芦醇、檞皮素和山柰酚的分析。 ( [1]高尧来，温其标，张福艳.食品与发酵工业.第28卷 第8期(2002)：68-7 ) ( [2] T.J.Seddon， M.0.Downey. Australian Journal of Grape and WineResearch， Issue 4(2008)：54-61 ) ( [3] E. Flaque. Lopez， E. Fernadez Gomez. J o urnal of Ch r omatographic Science， Vol.34(1996)：254-257 ) ThermoFisherSCIENTIFIC AN_C_LC-       葡萄酒历史悠久、品味独特、营养丰富，深受人们的喜爱。但对葡萄酒的保健功能研究却肇始于1987 年雷诺（Renaud）提出的“法国悖论”现象：在20 世纪法国人和其他欧洲人都一样吸烟和摄入大量肉类食品，但法国人罹患心脏病和高血压病却明显比其他国家低。通过大量科学研究，发现法国人喜欢饮用葡萄酒，而葡萄酒中含有大量多酚类化合物，如白藜芦醇，而该类化合物具有抗氧化作用，可以延缓机体衰老。再后发现葡萄酒中另一种多酚类- 黄酮类化合物，如槲皮素，具有软化血管、抗凝血作用，可以预防脑血栓、脑出血、急性心脏病[1]。随着人们对葡萄酒的保健功能不断加深，对其中的功能物质分析也有着更大的需求。