游离N-糖中结构特点检测方案(液质联用仪)

收藏
检测样品: 治疗类生物药品
检测项目: 结构特点
浏览次数: 86
发布时间: 2017-05-05
关联设备: 3种 查看全部
获取电话
留言咨询
方案下载

沃特世科技(上海)有限公司(Waters)

钻石21年

解决方案总数: 1406 方案总浏览次数:
400-875-8210
方案详情 产品配置单
本应用纪要介绍了一种利用RapiFluor-MS标记游离N-糖并采用配备荧光(FLR)检测器和ACQUITY QDa质谱检测器的ACQUITY UPLC H-Class Bio系统分析标记N-糖的精简方法。采用这一全新的监测工作流程,研究人员在30分钟内即可完成UPLC-FLR/MS分析的糖蛋白样品制备过程。除了能够缩短样品制备时间,RapiFluor-MS与2-AB相比,能够将荧光响应提高14倍,同时将MS响应提高160倍。这些改进使得研究人员能够将FLR检测和通过ACQUITY QDa实现的质谱检测应用到常规分析中。在本应用纪要中,我们将RapiFluor-MS与UPLC®-FLR-MS相结合,用于监测特性、质量和相对丰度各不相同的标记游离寡糖。

方案详情

[应用纪要1THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要1 Waters 利用RapiFluor-MS标记通过荧光和质谱检测技术监测不同的N-糖结构 Eoin F.J. Cosgrave、 Robert Birdsall和Sean M. McCarthy沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) ■缩短游离N-糖分析的样品制备时间 获得每个峰的荧光和质谱检测数据,提高游离寡糖监测的可信度 沃特世解决方案 GlycoWorks"RapiFluor-MS"N-糖分析试剂盒 ACQUITYQDa°质谱检测器 ACQUITY UPLCH-Class Bio系统 配备FTN的ACQUITY UPLC自动进样器 ACQUITY UPLC荧光检测器(FLR) ACQUITY UPLC BEH Amide游离寡糖分析专用柱 Empower3 FR2 CDS 关键词 游离寡糖,质谱检测, H-Class, ACQUITY, QDa, RapiFluor-MS 简介 糖基化修饰是蛋白类生物治疗药物最复杂的翻译后修饰之一。糖基化治疗药物的疗效与糖基化分布直接相关。多余的结构可能会对药物的PK/PD特性产生有利或不利的影响,而且与免疫反应相关。因此,糖基化修饰通常被视为一项关键品质属性(CQA)。在药物开发过程中,我们要对候选分子的糖基化分布进行深入研究和表征。然后在整个工艺开发、产品商业化以及批准后研究中对药物特征进行监测,以确保产品疗效和安全性。 本应用纪要介绍了一种利用RapiFluor-MS标记游离N-糖并采用配备荧光(FLR)检测器和ACQUITY QDa质谱检测器的ACQUITY UPLCH-Class Bio系统分析标记N-糖的精简方法。采用这一全新的监测工作流程,研究人员在30分钟内即可完成UPLC-FLR/MS分析的糖蛋白样品制备过程。除了能够缩短样品制备时间, RapiFluor-MS与2-AB相比,能够将荧光响应提高14倍,同时将MS响应提高160倍。这些改进使得研究人员能够将FLR检测和通过ACQUITY QDa实现的质谱检测应用到常规分析中。在本应用纪要中,我们将RapiFluor-MS与UPLC-FLR-MS相结合,用于监测特性、质量和相对丰度各不相同的标记游离寡糖。 LC条件 LC系统: ACQUITY UPLC H-CLass Bio 检测器: ACQUITY UPLCFLR检测器和ACQUITY ODa质谱检测器 色谱柱: ACQUITY UPLC BEH Amide游离寡糖分析 专用柱,130A,1.7 um,2.1 × 150 mm (部件号186004742) 柱温: 60℃ 样品温度: 10°℃ 进样体积: 2L 数据管理: Empower 3 FR2 CDS FLR设置 数据采集速率: 5 pts/s 激发波长: 265 nm 发射波长: 425 nm QDa设置 采样速率: 5 pts/s 质量范围: 500-1250Da 锥孔电压: 15V 毛细管电压: 1.5kV 探头温度: 500℃ 电离模式: ESI+ 流动相A: 乙腈(Pierce, LC-MS级) 流动相B: 50mM甲酸铵, pH 4.4(LC-MS级,沃特 世甲酸铵浓缩液) 流动相C: 乙腈(LC-MS级) 流动相D: 乙腈(LC-MS级) 时间 流速 %A %B %C %D (mL/min) 初始 0.400 0 35.0 0.400 0 0 36.5 0.200 0 39.5 0.200 42.5 0.200 47.4 0.400 0 0 0 055.0 0.400 0 使用随附于GlycoWorks RapiFluor-MSN-糖分析试剂盒(部件号176003606)中的沃特世完整单克隆抗体质量数检查标准品(部件号186006552)制备小鼠lgG1mAbN-糖样品。另外,使用核糖核酸酶B和牛胎球蛋白(Sigma Aldrich)制备N-糖样品。使用GlycoWorks RapiFLuor-MSN-糖分析试剂盒,按照《维护和使用手册》 (715004793)中提供的方案制备游离和标记N-糖混合样品。完成释放和标记步骤之后,使用CentriVapI干燥样品,并复溶于25乙腈/水/DMF混合物中(比例为22.5%:55.5%:22%)。每个示例中,目标载样量均为30pmol游离寡糖。使用沃特世甲酸铵浓缩液(部件号186007081)配制甲酸铵流动相。 结果与讨论 N-糖基化修饰根据蛋白质和表达系统不同,可产生大小、电荷和支化程度不同的多种游离寡糖结构。为了评估ACQUITY QDa检测质量范围以内及超出其质量范围的游离寡糖的能力,我们选择了三种糖蛋白(人源lgG、核糖核酸酶B和牛胎球蛋白),代表从中性双天线结构到四唾液酸化结构的常见游离寡糖。使用Rapid PNGaseF释放各种蛋白质的N-糖,并按照试剂盒提供的样品制备方案用RapiFluor-MS标记样品。通过UPLC-HILIC分离标记的游离寡糖,并使用ACQUITYFLR和ACQUITY QDa两种检测器进行检测。 由图1可以明显看出,采用单一梯度方法就使得所有游离寡糖结构成功实现了色谱分离。此外,在荧光检测谱图(上图)中观察到的所有游离寡糖结构都能在ACQUITY QDa质谱检测器谱图(下图)中观察到, 说明ACQUITY QDa能够检测结构和属性各不相同的多种RapiFluor-MS标记游离寡糖,.而电离效率较低的传统标记技术是无法获得这样的结果的。 利用质谱检测能够观察到游离寡糖结构这一点固然有用, 了解所得谱图的质量以及谱图中游离寡糖离子的电荷态也十分重要。为了掌握这方面的信息,我们对特性各异的多个游离寡糖峰进行了积分,并使用FLR积分数据测定了每个样品中不同物质的相对丰度。图2所示的谱图证明, ACQUITY QDa能够为特性和质量不同的多种游离寡糖结构生成高质量谱图。该数据还证明,高丰度及低丰度游离寡糖结构均可轻松检出。我们的数据表明,即使是荧光谱图中丰度低至0.5%的结构,ACQUITY QDa质谱检测也可生成高质量谱图,展现了ACQUITY QDa质谱检测与RapiFluor-MS的高电离效率优势相结可实现的灵敏度提升。另外利用RapiFluor-MS提高游离寡糖结构的电荷态,可以使小型结构(如A2)以及极大型的结构(如四唾液酸化A3G3S4)被QDa顺利检出。 ACQUITY FLReexx -260 nm7em 425 nm 寸NN 5 10 15min ACQUITY QDaTIC 300~1250 m/z 图1.ACQUITY QDa能够检出一系列RapiFluor-MS标记的N-糖。使用Rapid PNGase F从人源lgG(红色迹线)、核糖核酸酶B(黑色迹线)牛牛胎球蛋白(蓝色迹线)中释放游离寡糖,然后使用RapiFluor-MS试剂进行标记。然后通过HILIC分离各个游离寡糖混合样品,接着分别通过荧光(A)和质谱检测(B)技术进行检测。 图2.利用ACQUITYQDa质谱检测器检测选定RapiFluor-MS标记寡离寡糖所得的谱图。使用Rapid PNGase F释放小鼠/gG1mAb、核糖核酸酶B和牛胎球蛋白中的游离寡糖,并用RapiFluor-MS试剂进行标记。图中所示为图1分离出的游离寡糖结构中几种结构的代表性谱图。 ( 糖基化修饰是大多数治疗性蛋白质既复杂又关键的一个方面,我们必须对其进行准确表征。- 一般来说, , N-糖谱图都被视作一项关键品质属 性,因此是整个产品生命周期中都要监测的一项属性。如本应用纪要 所述,利 用 GlycoWorks RapiFluor-MSN-糖分析试剂盒制备样品可大大缩短样品制备时间并简化制备过程。此外,采用Ra p iFluor-MS可获得更高的FLR灵敏度,同时大幅提升MS灵敏度。得益 于 RapiFluor-MS标记技术对游离寡糖MS检测灵敏度的提升,分析人员现在可以应用ACQUITY QDa进行 质谱检测,从而提升在生物制药开发过程中对各种结构进行峰监测时 的可信度。总而言之, RapiFluor-MS标记与通过ACQUITY UPLC H-Class Bio系统和ACQUITY QDa质谱检测器实现的HILIC-FLR-MS检测相结合,为监测生物 治疗药物的N-糖谱图提供了一套卓越的解决方案。 ) THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters、 The Science of What’s Possible、ACQUITY、QDa、 ACQUITY UPLC、Empower和UPLC是沃特世公司的注册商标。GlycoWorks 和RapiFluor-MS是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 O2015年沃特世公司。中国印刷。2015年3月720005353ZH AG-PDF 北京:010-52093866 上海:021-6156 2666 广州:020-28295999 成戈:028-67653588 香港:852-29641800 免费售后服务热线:800(400)8202676www.waters.com 利用RapiFluor-MS标记通过荧光和质谱检测技术监测不同的N-糖结构 本应用纪要介绍了一种利用RapiFluor-MS标记游离N-糖并采用配备荧光(FLR)检测器和ACQUITY QDa质谱检测器的ACQUITY UPLC H-Class Bio系统分析标记N-糖的精简方法。采用这一全新的监测工作流程,研究人员在30分钟内即可完成UPLC-FLR/MS分析的糖蛋白样品制备过程。除了能够缩短样品制备时间,RapiFluor-MS与2-AB相比,能够将荧光响应提高14倍,同时将MS响应提高160倍。这些改进使得研究人员能够将FLR检测和通过ACQUITY QDa实现的质谱检测应用到常规分析中。在本应用纪要中,我们将RapiFluor-MS与UPLC®-FLR-MS相结合,用于监测特性、质量和相对丰度各不相同的标记游离寡糖。
确定

还剩2页未读,是否继续阅读?

不看了,直接下载
继续免费阅读全文

该文件无法预览

请直接下载查看

沃特世科技(上海)有限公司(Waters)为您提供《游离N-糖中结构特点检测方案(液质联用仪)》,该方案主要用于治疗类生物药品中结构特点检测,参考标准--,《游离N-糖中结构特点检测方案(液质联用仪)》用到的仪器有ACQUITY QDa质谱检测器、Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio 超高效液相色谱、Waters Empower 3 色谱数据软件

相关方案 更多