新生儿足跟血干血斑中氨基酸及酰基肉碱检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-357Excellence in Science Excellence in Science 上海市淮海西路570号红坊E楼咨询电话：021-22013542 http：//www.shimadzu.com.cn 非衍生化-三重四极杆液质联用法进行新生儿遗传代谢缺陷筛查的应用研究 LCMSMS-253 摘要：遗传代谢性疾病是一类由于单基因缺陷而引起代谢途径阻断的疾病。许多遗传代谢性疾病对新生儿危害极大，因此是新生儿筛查的主要内容。串联质谱用于新生儿筛查是自Guthrie 将细菌抑制法用于苯丙酮尿症筛查以来，新生儿筛查史上最重要的技术革新。本文建立了一种应用非衍生化-三重四极杆液质联用法检测新生儿足跟干血斑中氨基酸及肉碱的各项指标来进行遗传代谢缺陷筛查的技术。 关键词：新生儿筛查三重四极杆质谱仪非衍生化法氨基酸肉碱 国际新生儿遗传代谢病筛查发展趋势逐步提高到以串联质谱技术为中心的筛查。通过检测滤纸干血片中氨基酸和酰基肉碱浓度，进行氨基酸代谢、有机酸和脂肪酸代谢障碍等的筛查，使患儿得到早期诊断和及时治疗，避免体格和智力发育障碍。本文应用非衍生化样本处理的串联质谱技术(tandem mass spectrometry， MS/MS) 检测新生儿足跟血干血斑中的氨基酸及肉碱浓度，以便用于氨基酸、有机酸及脂肪酸代谢病的检测和筛查。 实验部分 1.1仪器 岛津高效液相色谱仪LC-20A与三重四极杆 质谱仪LCMS-8040CL 联用系统。具体配置为 LC-20ADXR×2输液泵， DGU-20A5在线脱气气，SIL-20AC 自动进样器，CTO-20AC柱温箱，CBM-20A 系统控制器，LCMS-8040CL三重四杆杆质谱仪，LabSolutions Ver.5.82色谱工作站；孵育震荡仪 (Labsystems iEMS)。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱：无，安装在线过滤器 流动相：0.05%甲酸水：乙腈：甲醇=1：2：2 初始流速： 0.1 mL/min 柱温：室温 自动进样器温度：4℃ 进样量：1pL洗脱方式：流速梯度见表1 表1梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.75 Pumps Total flow 0.1 0.76 Pumps Total flow 1.2 1.00 Controller Stop 质谱条件： 离子源 ： ESI，+ 扫描模式 ：MRM雾化气 ：3.0L/min 干燥气 ：12.0L/min加热模块：450℃ DL温度 ：250℃温度驻留时间 ：10ms MRM ：见表2 表2氨基酸、肉碱及其同位素内标的 MRM 参数 MRM Name Precursor ion Product ion CE 作者：任彪 北京分析中心 邮箱： fxrb@shimadzu.com.cn LCMSMS-253 45 C10：2 312.2 85.2 -27 46 C12 344.2 85.2 -27 47 C12：1 342.2 85.2 -27 48 C14 372.2 85.2 -24 49 C14：1 370.2 85.2 -27 50 C14：2 368.2 85.2 -27 51 C140H 388.5 85.1 -26 52 C14OH IS 403.5 85.1 -27 53 C16 400.5 85.1 -27 54 C16：1 398.5 85.1 55 C16：1OH 414.5 85.1 56 C16OH 416.5 85.1 -32 57 C18 428.5 85.1 -29 58 C18：1 426.5 85.1 59 C18：2 424.5 85.1 60 C18：1OH 442.5 85.1 61 C18OH 444.5 85.1 -29 1.3材料与方法 1.3.1材料 检测样本：待检测样本为滤纸干血片样本。采集微量血滴于S&S903滤纸上，室温下自然晾干，-20℃冰箱保存待用。 试剂：非衍生化法串联质谱法新生儿筛查检测试济盒，包含10种氨基酸及9种肉碱的同位素内标。 1.3.2方法 方法原理：使用含稳定同位素标记的氨基酸及肉碱内标的溶剂萃取滤纸干血片中的氨 基酸及肉碱，然后用MS/MS系统进行分析。 通过测定每个氨基酸及肉碱与其对应的同 位素内标的离子峰强度，由已知水平的内标， 即可通过岛津新生儿筛查软件自动计算出 所测样本的氨基酸及肉碱水平。 样本前处理方法：用直径3mm打孔器在滤纸血片上取样，置于96孔板中，每孔加入含氨基酸及肉碱同位素内标的甲醇溶液100uL， 45℃密封孵育震荡(650~750 rpm) 45min， 提取75 uL萃取液转移至V型底96孔板内，铝膜覆盖，， _上机检测。如图1所示 3 mm (1/8 inch) 图1样本前处理及分析流程 结果讨论 2.1标准品的 MRM色谱图 图2含混合内标的提取液色谱图 2.2精密度考察 取试剂盒内提供的高、低2个水平的质控品，每次各测定25个样本，连续测定10天，得出批内和批间变异系数(CV)，结果显示：：氨基酸低值的批内变异系数范围为2.5%-9.6%，平均值为5.8%，批间变异系数范围为 3.3%-10.8%， 平均值为7.1%；氨基酸高值的批内变异系数范围为2.0%-10.7%，平均值为5.3%，批间变异系数范围为2.8%-14.0%，平均值为6.2%；肉碱低值的批内变异系数范围为1.7%-12.8%，平均值为5.5%，批间变异系数范围为2.3%-14.0%，平均值为6.5%；肉碱高值的批内变异系数范围为1.0%-8.3%，平均值为4.2%，批间变异系数范围为2.9%-12.0%， 平均值为6.2%。计算结果详见表3-6。 2.3准确度考察 取试剂盒厂商提供的5个不同批号室间质控品进行检测，对其中的氨基酸和肉碱进行分析，计算检测值与靶值的相对误差及判断检测值是否在靶值2倍标准偏差范围内。结果显示：低浓度氨基酸 QC 样本检测值与靶值相对误差绝对值范围为0.3%-9.7%；高浓度氨基酸QC样本检测值与靶值相对误差绝对值范围为1.9%-14.0%；低浓度肉碱QC样本检测值与靶值相对误差绝对值范围为0.7%-28.2%；高浓度肉碱 QC样本检测值与靶值相对误差绝对值范围为1.1%-25.9%，所 有检测值均在靶值2倍 SD 范围内。计算结果详见表7-10. 2.4临床应用 从新生儿遗传代谢缺陷筛查样本中，得到了3个已经过诊断证明指标异常的样本，用本文建立的方法进行了相关检测，具体结果如表11 所示。 表11异常样本检测结果 样本号 异常指标 实测值 参考值 C4OH/C3DC 0.56 0.02-0.27 C4OH/C3DC/C4 2.07 0.13-1.50 2 C4OH/C3DC/C10 6.39 0.001-5.00 C4OH/C3DC 0.36 0.02-0.27 C4OH/C3DC/C4 2.59 0.13-1.50 C4OH/C3DC/C10 11.67 0.001-5.00 3 C10：2/C10 1.42 0.001-1.20 C4OH/C3DC 0.75 0.02-0.27 C4OH/C3DC/C4 2.89 0.13-1.50 C4OH/C3DC/C10 19.37 0.001-5.00 Ala 389 62.5-328.0 *结果仅作为研究用，无临床参考意义 结论 本文利用岛津高效液相色谱仪LC-20A与三重四极杆质谱仪 LCMS-8040CL 联用系统成功建立了非衍生化液相串联质谱法测定干血斑中氨基酸及肉碱的浓度的方法。通过精密度、准确度的考察，证明该方法可以快速、准确、稳定的进行氨基酸及肉碱含量的检测；通过异常样本的检测结果可以得出，该方法能够正常检测出异常样本，能够满足临床检测的应用。 表3低浓度氨基酸 QC 批内与批间 CV 目标物 Ala Val Gly Orn Arg Leu Met Phe Tyr Cit Pro concentration 212.8 322.8 367.2 97.4 26.7 331.6 85.8 203.7 240.6 62.8 175.2 批内 CV 5.3% 2.6% 9.4% 5.4% 6.5% 3.2% 9.6% 2.5% 6.5% 9.4% 3.0% 批间 CV 9.9% 3.3% 10.6% 5.9% 7.5% 4.3% 10.6% 3.7% 6.7% 10.8% 4.7% 表4低浓度氨基酸 QC 批内与批间CV 目标物 Ala Val Gly Orn Arg Leu Met Phe Tyr Cit Pro concentration 286.1 970.4 422.1 176.3 85.7 929.6 474.6 663.4 646.3 267.2 212.4 批内 CV 6.3% 3.9% 10.7% 4.9% 4.3% 2.9% 4.6% 2.0% 6.8% 7.4% 4.1% 批间 CV 7.7% 4.1% 14.0% 5.2% 5.0% 3.1% 5.8% 2.8% 7.1% 8.5% 4.6% 表5低浓度肉碱 QC批内与批间 CV 目标物 C0 C2 C3 C4OH/C3DC C4 C50H/C4DC C5 C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18 concentration 16.3 15.6 3.5 0.3 1.1 1.1 0.5 0.4 0.5 0.3 0.4 0.4 3.5 1.3 批内 CV 2.4% 1.7% 2.3% 9.1% 2.7% 4.7% 3.6% 5.2% 6.2% 12.8% 11.5% 10% 1.7% 3.2% 批间CV 3.5% 2.9% 3.9% 10.0% 3.6% 5.2% 5.1% 6.9% 6.9% 14.0% 11.9% 11% 2.3% 3.6% 表6高浓度肉碱 QC 批内与批间 CV 目标物 C0 C2 C3 C4OH/C3DC C4 C50H/C4DC C5 C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18 concentration 36.7 32.9 11.6 0.8 4.8 2.8 2.6 1.8 2.1 1.4 1.7 3.2 9.2 5.0 批内 CV 1.8% 1.6% 2.5% 5.6% 3.5% 4.9% 2.7% 4.8% 4.5% 8.3% 8.1% 8% 1.0% 1.7% 批间CV 5.1% 3.3% 3.1% 6.6% 3.1% 5.4% 6.0% 6.3% 5.2% 11.6% 11.8% 12% 2.9% 4.4% 表7低浓度氨基酸QC样本检测准确度评价 目标物 Ala Val Gly Orn Arg Leu Met Phe Tyr Cit Pro 测定均值 228.8 311.8 354.6 89.3 8.6 330.6 83.0 197.0 212.4 56.0 173.0 靶值 213.2 291.9 367.4 85.6 9.5 322.4 91.4 196.4 221.7 56.2 165.0 相对误差 7.3% 6.8% -3.5% 4.3% -9.7% 2.5% -9.2% 0.3% -4.2% -0.4% 4.8% 2倍SD靶值范围 159.6-266.8 213.5-370.19 283.9-450.8 55.4-115.9 5.6-13.4 238.7-406.1 69.2-113.6 140.7-252.2 153.8-289.5 39.4-72.9 112.8-217.2 表8低浓度氨基酸QC样本检测准确度评价 目标物 Ala Val Gly Orn Arg Leu Met Phe Tyr Cit Pro 测定均值 237.6 827.0 370.1 119.6 67.2 752.3 384.0 544.0 484.9 211.3 163.6 靶值 231.2 842.9 395.5 134.9 74.1 843.9 443.9 609.1 563.9 232.3 169.3 相对误差 2.8% -1.9% -6.4% -11.4% -9.3% -10.9% -13.5% -10.7% -14.0% -9.0% -3.4% 2倍SD 靶值范 184.2- 628.7- 307.7- 84.1- 47.6- 643.2- 360.5- 450.8- 417.9-729.8 169.4- 124.1- 围 278.3 1057.2 483.3 185.7 100.7 1044.6 587.2 769.5 295.3 214.6 表9低浓度肉碱QC样本检测准确度评价 目标物 C0 C2 C3 C4OH/C3DC C4 C5OH/C4DC C5 C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18 测定均值 16.7 15.7 3.5 0.3 1.1 1.0 0.5 0.4 0.5 0.3 0.3 0.4 3.4 1.4 靶值 18.8 17.7 3.9 0.3 1.1 1.2 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.5 3.9 1.4 相对误差 -11.2% -11.5% -9.0% 20.0% -3.5% -10.4% -14.4% -13.0% -9.6% -28.2% -20.2% -13.4% -13.5% -0.7% 2倍SD靶值 范围 14.6- 23.3 11.3-23.4 2.7-5.0 0.2-0.4 0.9-1.4 0.9-1.4 0.4-0.7 0.4-0.6 0.3-0.7 0.2-0.6 0.3-0.6 0.3-0.7 3.0-4.8 1.0-1.8 表10高浓度肉碱 QC样本检测准确度评价 C0 C2 C3 C4OH/C3DC C4 C5OH/C4DC C5 C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18 测定均值 36.7 32.9 11.6 0.8 4.8 2.9 2.6 1.8 2.2 1.4 1.7 3.2 9.2 5.0 靶值 38.2 35.5 12.0 1.0 4.7 2.8 2.8 2.0 2.3 1.9 2.0 3.5 10.1 4.8 相对误差 -4.1% -7.3% -3.6% -20.6% 1.1% 3.3% -7.8% -8.5% -5.3% -25.9% -15.3% -9.3% -8.9% 5.2% 2倍SD靶值 范围 28.3- 49.0 23.3- 46.8 8.1- 15.8 0.6-1.4 3.7- 5.8 2.1-3.4 2.3-3.5 1.5-2.5 1.5-3.0 1.1-2.7 1.4-2.8 2.2-4.9 7.3- 13.1 3.4-6.2 田岛津全球应用技术开发支持中心 本文利用岛津高效液相色谱仪LC-20AD与三重四极杆质谱仪联用系统LCMS-8040CL成功建立了非衍生化液相串联质谱法测定新生儿足跟血干血斑中氨基酸及酰基肉碱浓度的方法。通过精密度、准确度的考察，证明该方法可以快速、准确、稳定的进行氨基酸及酰基肉碱含量的检测；通过阳性样本的检测结果可以得出，该方法能够正常检测出阳性样本，能够满足临床检测的应用。