低聚半乳糖的含量中低聚半乳糖的含量检测方案(流量计)

北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923食品科技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2012年第37卷第7期 高效液相色谱法测定低聚半乳糖的含量 李静芳，彭美纯(湖南亚华乳业有限公司，长沙410200) 摘要：研究了高效液相色谱法测定乳制品及糖浆中低聚半乳糖含量的方法。以水和乙腈为流动相，用氨基柱将葡萄糖，半乳糖和乳糖与其他物质分离，用示差折光检测器检测，定量。通过计算低聚半乳糖酶解成的半乳糖含量，来对低聚半乳糖定量。葡萄糖，半乳糖，乳糖和低聚半乳糖的相对标准偏差分别为2.72%、4.16%、1.16%、4.26%。此法的线性相关系数为0.9990~0.9995，回收率达到95%~110%。此法能快速准确的测定低聚半乳糖的含量。 关键词：高效液相色谱；低聚半乳糖；半乳糖； B-半乳糖苷酶 中图分类号：TS 287.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)07-0279-04 Determination of galactooligosaccharide by high performance liquidchromatography LI Jing-fang， PENG Mei-chun(Hunan Avadairy CO.，Ltd.， Changsha 410200) Abstract： HPLC method was established to determine the galactooligosaccharide in dairy productsand syrup. Glucose， galactose and lactose were simultaneously assayed on a NH， column by usinga refractive index detector and a mobile phase of acetonitrile-water.β-Galactosidase can hydrolyzeGOS into galactose. Then GOS are calculated from concentrations of lactose and galactose. Therelative standard deviation was 2.72%， 4.16%，1.16%，4.26% for glucose， galactose， lactose andgalactooligosaccharide respectively. The method presented linear correlation coefficient between 0.9990and 0.9995. The recovery ranged from 95% to 110%. This method was proved to be accurate and rapid. Key words： HPLC； galactooligosaccharide； galactose； B-Galactosidase 低聚半乳糖(Galactooligosaccharides， GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，对肠内的益生菌群有很强的增殖作用，同时具有和植物纤维相同的效用，可促进肠胃蠕动，改善肠道功能。2008年中国卫生部批准低聚半乳糖为新资源食品，并规定了相应的使用标准。此后低聚半乳糖 作为一种新的功能性食品在我国食品行业得到广泛的应用。不仅如此，低聚半乳糖还被称为母乳化的益生元，成为婴幼儿食品的配方之一。 低聚半乳糖是以乳糖为原料，经β-半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷键，生成半乳糖唐葡萄糖，并通过转半乳糖苷的作用，将水解下来的半乳糖 ( 收稿日期：2011-10-11 ) ( 基金项目：国家高技术发展计划项目(2010AA23004)；长沙市重大专项(K1003191-21)。 ) ( 作者简介：李静芳(198 4 一)， 女 ，工程师，主要从事食品分析方面的研究工作。 ) 苷转移到半乳糖分子，生成低聚半乳糖。其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1~7个半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n为0-6)。目前没有低聚糖的标准品，不能直接测定其含量。因此，只能通过酶水解使低聚半乳糖转化为半乳糖的方式来计算低聚半乳糖的含量，即用水解后半乳糖的总量减去游离的半乳糖含量和无水乳糖水解产生的半乳糖含量，从而计算出试样中低聚半乳糖的含量。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 1.1.1 试剂 亚铁氰化钾：分析纯，150 g/L；乙酸锌：分析纯， 300 g/L；乙腈：美国Sigma公司；色谱纯；磷酸缓冲缓液(钾盐)：分析纯，0.2 mol/L，pH值为6.0；淀粉酶：美国Sigma公司，活力大于1.5U/mL；B-半乳糖苷酶溶液：美国Sigma公司，活力大于400 U/mL；标准品：葡萄糖、半乳糖、乳糖，均为美国Sigma公司。 1.1.2仪器 分析天平(感量0.0001g)：瑞士梅特勒-托利多公司； Waters2695高效液相色谱系统：配有Waters2414示差折光检测器，美国Waters公司；水浴锅。 1.2 分析步骤 1.2.1 样品前处理 糖浆：称取约1g试样，精确至0.0001g，加水溶解，定容至10 mL，摇匀。乳制品：固体样品称取3g，精确至0.0001g，加入10mL 60℃的水充分溶解；液体样品则称称15g，精确至0.0001 g。若试样中含有淀粉，则加入0.2g淀粉酶，摇匀，60℃水解30 min。称样量要保证试样中各组分的含量在标准曲线的线性范围内。冷却后加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各1mL，静置10 min后定容至25 mL，摇匀。 1.2.2 待测液的制备 样液用滤纸过滤，取滤液用0.45 um的滤膜过滤作为待测液A。另取5mL滤液至10mL比色管中，再加1 mLβ-半乳糖苷酶溶液，摇匀，定容，于(60±2)℃下振荡器轻微振荡60 min， 迅速冷却至室温后过滤，用0.45 um滤膜过滤，收集滤液，作为待测试样液B。 1.2.3 混合标准溶液的配制 分别准确称取1.0000g的葡萄糖、乳糖和2.0000 g的半乳糖，用水溶解并定容至50 mL，配成的混标中葡萄糖和乳糖的浓度为20 mg/mL，半乳糖的浓度为40 mg/mL。 1.2.4 标准曲线 分别吸取糖标准液0.50、1.00、 2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL于10mL容量瓶中，用水稀释定容，分别吸20 uL注入高效液相色谱仪，以葡萄糖、半乳糖和乳糖的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。 1.2.5 色谱条件 色谱普：氨基柱，250 mm×4.6mm，5um；柱温：30℃；流动相：乙腈：水=70：30；流速：1.0 mL/min； 示差折光检测器内温：40℃；进样量：20~50uL。 1.2.6计算 式中：GB为加入半乳糖苷酶水解反应管中的半乳糖含量，%；GL为样品中乳糖水解产生的半乳糖含量，为乳糖含量除以系数1.9，%；GA为游离半乳糖含量，%； k=(180+162n)/(180×n) 式中：n为低聚糖的聚合度。 2 结果与分析 2.1 沉淀剂的选择 分别用乙腈和亚铁氰化钾、、乙酸锌做沉淀蛋白质的实验。乙腈沉淀蛋白质时，比例不好控制，蛋白质沉淀不完全，滤液放置一段时间又会有沉淀析出，而且乳糖的回收率只有70%；而亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白质的效果较好，回收率也能达到要求。 2.2 色谱条件的选择2-3 由于葡萄糖和半乳糖2个峰不易分离，所以在此法中对氨基柱的柱效要求比分离其他糖类物质要高。当柱效逐渐降低后，葡萄糖和半乳糖的2个峰就会重叠，其色谱图见图1. 注：1为葡萄糖和半乳糖的重叠峰，2为乳糖。图1葡萄糖和半乳糖峰形重叠的色谱图 分别用乙腈含量为65%、70%、75%的流动相进行了分离度试验。流动相中乙腈含量为65%时葡萄糖和半乳糖的峰重叠，乙腈含量70%、75%的流动相做出来的葡萄糖和半乳糖的分离效果差别 食品安全与检测 不大，考虑到成本和实验时间，最终选用乙腈含量70%的流动相。分离结果见图2、图3。 时间/min 注：1为葡萄糖，2为半乳糖，3为乳糖。 图2混合标准品色谱图 时间/min (a)混合标准品色谱图 注：1为葡萄糖，2为半乳糖，3为乳糖。500 4001 -300 1 3 200：9 1100 9 60 32 4 6 8 10 12 14时间/min(b)奶粉(水解前)色谱图注：1为葡萄糖，2为半乳糖，3为乳糖。 寸 16 18 400 300- 200 3 12 100 2 4 6 8 10 12 141618 时间/min (c) 糖浆色谱图注：1为葡萄糖，2为半乳糖，3为乳糖。 图3混合标准品、奶粉、糖浆色谱图 2.3 β半乳糖苷酶酶解条件的选择 分别取5 mL奶粉试样的滤液于10 mL比色管中，用不同体积的酶液和酶解时间做实验，结果 见表1。从表中得知，加1 mL酶液时60 min可酶解完全，加2mL酶液时45 min可酶解完全，加3mL酶液时30 min可酶解完全。考虑到β-半乳糖苷酶的成本较高，而酶解时间差别不大，因此酶解条件选择1mL酶液酶解60 min。此酶解条件应用到其他样品中时应根据其样品中乳糖和低聚半乳糖的含量而适当调整。 表1 酶解条件实验 含量体积/ 时间/min mL 30 45 60 75 0 B：0.83%B：0.82% B：0.83% B：0.84% R：40.60%R： 40.59%R：40.62%R：40.61% 1 B：9.98%B： 17.99% B： 24.35%B： 24.40% R：24.99%R：10.82% R： 0% R： 0% B： 19.03%B： 24.40%B：24.41%B：24.38% 2 R：8.99% R：0% R： 0% R：0% 3 B：24.33%B： 24.36%B： 24.32%B：24.32% R：0% R： 0% R：0% R： 0% 2.4 线性关系及检出限 分别绘制葡萄糖、半乳糖和乳糖的标准曲线，在1~20 mg/mL范围内葡萄糖和乳糖质量浓度与峰面积线性关系良好，在2~40 mg/mL范围内半乳糖质量浓度与峰面积线性关系良好，其线性方程及相关系数见表2。根据检出限为S/b，并以信噪比(S/N)为3计算检出限4，结果见表2。 表2 7葡萄糖、半乳糖和乳糖的回归方程、线性范围和检测限 糖 线性方程 线性范围/ (mg/mL) 相关系数 检出限/ mg/g) 葡萄糖Y=11282X+22349 1~20 0.9991 0.5 半乳糖 Y=2255X+1956 2~40 0.9990 3.0 乳糖 Y=7774X-1837 1~20 0.9995 0.8 2.5 精密度实验 表3精密度实验 次数 含量/(mg/g) 葡萄糖 半乳糖 乳糖 低聚半乳糖 1 13.9 8.11 397 21.7 2 14.1 7.86 394 20.7 3 13.4 8.54 406 19.0 4 14.1 8.79 403 20.4 5 13.1 8.73 405 21.1 6 13.8 8.38 403 21.3 7 13.9 8.12 397 20.3 平均值 13.8 8.36 401 20.6 RSD(n=7)/% 2.72 4.16 1.16 4.26 取一添加了低聚半乳糖的奶粉样品，重复测定7次，计算相对标准偏差(RSD)，结果见表3。由表可见相对标准偏差均小于5%，说明方法的精密度良好。 2.6 回收率实验 由于无法直接添加低聚半乳糖进行回收试验，因此只能采用添加葡萄糖，半乳糖和乳糖标准品的方法来计算回收率。在低聚半乳糖完全酶解的前提下，若半乳糖的回收率能达到要求就认为此法中低聚半乳糖的回收率也能达到要求。 取一已知糖含量的奶粉样品，分别添加0.03g和0.06 g的葡萄糖、半乳糖、乳糖标准品，每一梯度取3个样，测定方法的回收率，结果见表4。 表4回收率实验 添加量 回收率/g 葡萄糖 半乳糖 乳糖 0.03 95.83 101.72 101.78 0.03 98.40 106.66 109.05 0.03 98.67 109.53 106.32 0.06 103.04 107.89 99.93 0.06 109.81 110.38 108.30 0.06 105.54 106.23 107.25 平均值 101.88 107.07 105.44 从表4得知，回收率在95%~110%之间，表明此法准确度较高。 3 结论 目前测定低聚半乳糖的方法很多，有离子色 谱法5，离子交换树脂-薄层层析法6，高效液相柱前衍生化法，高效液相色谱-糖柱法等。前3种方法都要配制大量的试剂和复杂的前处理，比较繁琐。与糖柱相比，虽然氨基柱分离葡萄糖和半乳糖时的分离效果不如糖柱好，但是氨基柱价格低，容易保养，且适合分离大分子的糖，在本方法中精密度和回收率也能达到要求。 总之，本方法不需要复杂的前处理过程，精密度和回收率良好，是检测低聚半乳糖的快速简单准确的方法。 ( 参考文献： ) ( 1 Slegte J. 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