啤酒中4-甲基咪唑检测方案(超声波清洗器)

啤酒中4-甲基咪唑含量的测定 焦糖色是我国允许使用的一种食用着色剂，应用广泛，涵盖食品、酿酒、制药等多个领域。国际上通常按其生产工艺把焦糖色分为四类：Ⅰ普通焦糖；Ⅱ亚硫酸钾钠焦糖；Ⅲ氨焦糖；Ⅳ亚硫酸铵焦糖。我国GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定啤酒中Ⅲ、Ⅳ类焦糖色使用限量为50g/L。Ⅲ、Ⅳ类焦糖色在生产过程中会产生一定量的有害物质4-甲基咪唑（4-MEI），GB 8817-2001《食品添加剂 焦糖色（亚硫酸铵法、氨法、普通法）》中规定，4-甲基咪唑在焦糖色中含量小于0.02%，然而啤酒并无相关卫生标准。 研究表明，4-MEI能导致动物长肿瘤，有可能给人体带来致癌风险，2007年美国国家毒理学计划（NTP）将其列为致癌物。2011年《加州65号提案》确定其无显著风险水平（NSRL）为每天0.045mg/kg。目前，4-MEI检测方法主要有分光光度法、色谱法和色谱-质谱联用法等。国内对4-MEI的检测主要集中于焦糖色原料，其次是对其相关食品酱油和可乐，对啤酒中4-MEI含量测定鲜见报道。本研究建立固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定啤酒中4-MEI含量，旨在为啤酒的安全性评价以及相关标准的制定提供技术支持。 1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂 液质联用仪，高速离心机、十万分之一电子天平、漩涡振荡器、超声波清洗器、真空过柱装置。 Agala PCX固相萃取柱（60mg/3ml），临用前依次用3ml甲醇活化和3ml水平衡；4-MEI标准品（含量99.4%），4-MEI-D5（含量为98.7%），乙腈、甲醇、甲酸（纯度≥98%）均为色谱纯，氨水（分析纯），盐酸（优级纯），水为超纯水。其他试剂均为分析纯。 1.2 方法 1.2.1 标准溶液的配置 4-甲基咪唑标准储备液的配置：称取4-MEI 6.29mg（精确至0.0001g），用水溶解后转移至25ml容量瓶中，加水定容配置成质量浓度为250μg/ml的标准储备液，于4℃条件下保存。精密量取上述储备液适量，加水制成每1ml含1.0μg的标准使用液，用于标准曲线的配置。 4-MEI-D5标准储备液的配置：称取4-MEI-D5 9.38mg（精确至0.0001g）用水溶解后转移至25ml容量瓶中，加水定容，配置成质量浓度为370μg/ml的标准储备液，于4℃条件下保存。精密量取上述储备液适量，加水制成1ml含0.5μg的对照内标使用液。 1.2.2 样品处理 提取：将啤酒倒入烧杯中超声10min除尽热氧化碳，取约5.0g（精确至0.01g）于100ml容量瓶中，加入水至刻度，混匀。10000rpm离心5 min，取上清液备用。 净化：移取约1.00ml提取液加入1.8ml水，加入100μl 0.02mol/L盐酸溶液，加入100μl内标使用液，混匀后倾入已活化的固相萃取小柱中，待液体全部流出后，用3ml水、3ml甲醇淋洗小柱，用3ml含5%氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，置于45℃水浴氮吹浓缩至干，残渣用1.00ml水溶解，过0.22μm滤膜后，待测。 1.2.3 在本实验中恒奥科技可提供使用的仪器 超声波清洗器 漩涡混合器 固相萃取装置 氮吹仪 1.2.4仪器条件 色谱条件：色谱柱Waters ACQUITY BEH C18柱（100mm×2.1mm，1.7μm），柱温30℃；进样体积10μl；流动相A为5 mmol/L甲酸铵，流动相B为乙腈，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。 质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI+）；扫描方式：多反应监测（MRM）。毛细管电压0.5kV，离子源温度150℃，脱溶剂气温度450℃，脱溶剂气流量700L/h，其他参数见表2。 2 结果与分析 2.1 固相萃取柱的选择 4-MEI是极性较强的碱性杂环环合物，因此阳离子固相萃取柱对其有较高的选择性和灵敏度。本研究比较了4种阳离子固相萃取柱：Agala Cleanert PCX（60mg/3 ml）、Thermo CX（60mg/3 ml）、Waters Oasis MCX（60mg/3 ml）和Isolute HCX（60mg/3 ml）的萃取效率。采用纯水加4-EMI-D5内标，过柱净化后计算柱子的绝对回收率，结果见表3.实验结果表明，PCX和CX回收率较高，因此本实验采用PCX固相萃取柱。 2.2 仪器条件选择 2.2.1 色谱柱选择 4-MEI是强极性化合物，在反相C18柱上不易保留。本实验首先采用ACQUITY UPLC HSS T3（2.1mm×100mm，1.8μm）亲水色谱柱进行条件摸索。HSS T3柱上4-MEI保留较好，灵敏度高，但在实际样品测定中存在样品基质干扰。采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×100mm，1.8μm）色谱柱，可降低乙腈比例实现了目标峰与干扰组分的完全分离，见图1 。 2.2.2 流动相的选择 4-MEI具有较强的亲水性，在色谱柱上的保留较弱，为了兼顾4-MEI在色谱柱上的保留与质谱上的响应，对乙腈-5mmol/L甲酸铵、乙腈-5mmol/L乙酸铵和乙腈-水三种流动相体系进行了考察。结果表明，5%乙腈比例3种流动相保留时间差别不大，但在乙酸铵和水体系下，4-MEI色谱峰拖尾严重，灵敏度下降近10倍。因此本实验采用乙腈-5mmol/L甲酸铵作为流动相，色谱峰峰形较好，灵敏度高，见图2. 2.2.3 质谱条件的选择 本实验采用超高效液相色谱-串联质谱法进行测定，具有更高的灵敏度和选择性。实验中，通过直接进样法确定4-MEI母离子质量数（m/z 82.79），在此基础上优化碰撞能进行子离子扫描，得到m/z为56.23、、42.13、28.08三个子离子，选择丰度最高的m/z 56.23作为定量离子，由于m/z 42.13在样品测定时有干扰，故而选择m/z 28.08作为定性离子。 2.3 检出限、精密度、回收率及线性范围 分别移取一定体积的4-MEI标准使用液于1.5ml进样瓶中，加入100μl 4-MEI-D5内标使用液，加水补足至1ml。配置成4-MEI浓度分别为1.00、2.00、5.00、20.0、50.0、100和200μg/L的标准曲线，进样测定，以4-MEI定量离子的峰面积与内标峰面积的比值对4-MEI浓度进行线性回归，线性方程为y=0.04174x-0.06122，相关系数r为0.9993，表明4-MEI在1～200μg/L范围内线性关系良好，以3倍信噪比计算4-MEI检出限为6μg/kg。 取已知浓度的啤酒样品分别加入高、中、低3种浓度水平的4-MEI进行测定，计算回收率，如表4所示，3个加标浓度水平下所得平均回收率均在88.2～89.6%之间，相对标准偏差均小于5%。 2.4 实际样品测定 应用该方法对市场上随机购买的11种啤酒进行检测，4-MEI均有检出，含量在0.0523～0.390mg/kg之间。 3 小结 采用固相萃取净化样品，超高效液相色谱-串联质谱法测定啤酒中4-甲基咪唑含量，样品处理简单，方法灵敏度高，准确度好，分析时间短，大大提高了工作效率，同时也为啤酒的使用安全性评价提供了技术支撑。