单克隆抗体药物中主要物质含量分析检测方案

MAbs分离色谱图 可行性分析 利用生物兼容高效液相色谱仪，选择合适的疏水作用色谱柱(HIC)分别对融合蛋白和单克隆抗体样品中结构异构体的杂质蛋白与主成分进行有效的分离。 引言 融合蛋白是通过 DNA 重组技术得到的两个或者多个基因重组后的表达产物。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白，可以增加在体内表达后产物的稳定性，也可以通过融合提高蛋白药物的疗效(如IL-3和GM-CSF)，也有与分泌性蛋白的信号肽基因组成融合基因，以使表达产物分泌到膜外或胞外，简化下游纯化过程，降低成本。其中Fc-融合蛋白治疗药物已经被证明在临床治疗中取得了很大成功"。 单克隆抗体药物作为生化药物已经在治疗很多疾病的过程中发挥重要的作用，尤其是在癌症的治疗方法中，已经商品化的 MAbs 药物包括罗氏公司的帕妥珠单抗、诺华公司的依维莫司等等。 作为治疗蛋白药物，单克隆抗体和融合蛋白的结构表征和质量控制至关重要，特别相对于常规小分子药物，大分子蛋白药物具有更大的挑战。随着分离检测技术的发展，目前可采用多种方法对药物蛋白进行很好地质量控制，包括毛细管电泳(CE)、体积排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEC)、疏水作用力色谱(HIC)和反相色谱(RP)等等，其中 HIC以蛋白质疏水性为基础，依据蛋白表面疏水性差异进行分离，与RP相比，表面吸附强度更低，因此不会扰乱蛋白质分子的结构，而且在RP中，常用的有机溶剂(乙腈或者甲醇)能够促进蛋白质分子的变性，因此 HIC 是比较温和的分离技术，对一系列蛋白质具有优良的活性再现性，但是相对而言， HIC 的分辨 率和柱效都比比上RP，因此最大程度提升 HIC 色谱柱的分离度和柱效是蛋白药物分析亟待解决的问题。 最新的 MAbPac HIC-10 色谱柱改变了填料的键合相，能够对融合蛋白及其结构的异构体进行很好地分离，与目前市场上同类的 HIC 色谱柱相比具有显著的优势。 ( 仪器： ) ( Thermo Scientific Dionex Ulti m ate 3000 x2 LC系统，包括： ) ( 一DGP 3600 AB双三元液相色谱梯度泵系统(包括在线脱气单元) (P/N5037.0014) ) ( 一WPS-3000TRS带温控自动进样器(P/N5840.0020)一TCC-3000SD 柱温箱(P/N5730.0010) ) ( - D AD 3000紫外 二 极管阵列检测器(P/N5082.0010) Thermo ScientificM DionexM Chrom e leonM 7.2色谱数据系统 ) 色谱条件： 流速：：1.0mL/min ( 色谱柱： The r mo Scientifi c M P r oPac HIC-10， 5 pm， 4.6 × 100mm (P/N 063655) Thermo S cientificM MAbPac HIC-10， 5 pm， 4.6×100mm (P/N 063655) ) UV检测波长：214nm 进样量：：10pL； 流动相： (A)0.1M NaH，PO+2 M(NH)2S0+7%异丙醇， pH 7.0(B) 0.1 M NaH，P0+7%异丙醇，，pH7.0 客户提供两个蛋白药物样品，包括融合蛋白溶液(约1mg/ml)和MAbs 溶液(约1.5mg/ml)，保存在-20℃条件下。 梯度条件1：0-30 min， 5%-100% B； 梯度条件2：0-5min， 25% B； 5-30 min， 25-60% B 温度：30℃ 高温降解前处理过程：取MAbs样品溶液，在恒温箱60℃放置24小时后，10000转/min离心5 min 后取上清液，直接上机分析。 融合蛋白分离色谱图 图1. ProPac HIC-10色谱柱分离融合蛋白谱图(梯度条件1) 图 2.MAbPac HIC-10 色谱柱分离融合蛋白谱图(梯度条件1) 图3.MAbPac HIC-10 色谱柱分离融合蛋白谱图(梯度条件2) 图 4. ProPac HIC-10 色谱柱分离 MAbs谱图(梯度条件1) 图5.MAbPac HIC-10色谱柱分离 MAbs谱图(梯度条件1) 图6.样品 MAbs 在高温降解前后的杂质峰变化图谱(梯度条件1) 结果与讨论 客户提供融合蛋白和单克隆抗体：(MAbs)两种样品。 由于在客户自己实验室融合蛋白样品只出现一个较宽的色谱峰，而通过其它方法可知该融合蛋白样品中含有断裂几个氨基酸和蛋白三级结构发生变异的杂质融合蛋白，本实验采用 Thermo fisher 的两根 HIC 色谱柱对该融合蛋白进行分离，并比较在 ProPac HIC-10 和最新的 MAbPac HIC-10色谱柱上的分离结果。两根 HIC 色谱柱都能够对融合蛋白及其中杂质进行较好分离，得到主峰和前后各一个杂质峰(前杂质峰-断裂几个氨基酸的融合蛋白，后杂 质峰-蛋白三级结构差异的融合蛋白)，尤其是 MAbPacHIC-10色谱柱，三个色谱峰分离更出色(图2)，通过优化梯度条件，三个色谱峰在梯度条件2的条件下能够得到最佳的分离图谱(图3)。 分别用 ProPac HIC-10 和 MAbPac HIC-10色谱柱对 MAbs 样品进行分离， MAbPac HIC-10 的分离优势更突出，图5中在主峰前后有两个显著的杂质峰。通过 MAbs 的高温降解实验，图6显示，主峰峰面积显著降低，而后面的杂质峰也有明显提高，因此采用 MAbPac HIC-10色谱柱能够更好地监控 MAbs 药物的质量，保证用药的安全性。 最新的 MAbPac HIC-10色谱柱在蛋白药物疏水性差异的杂质蛋白分离分析中具有更高的分离度和柱效，可以有效改善目前 HIC 色谱柱的分离性能，提高蛋白药物的疏水性分离能力，是目前市场上 HIC 分离的最佳选择。 ( [1] Beck， A.； Reichert， J . M. Therapeutic F c-fusion p roteins andpeptides as successful alternatives to antibodies， MAbs， 2011， 3(5)415-6. ) ( [2] Douglass， J.V.；Wallace， A.； Balland， A. Separation of populations of antibody variants by fine tuning of hydrophobic-interactionchromatography operating conditions， J. C h romatogr. A.， 1214(2008)81-89. ) 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 免费服务热线：800810 5118400 6505118(支持手机用户) ThermoFisherSCIENTIFIC AB_C_LC-