氨基酸中两种直接分析检测方案

直接分析氨基酸的两种方法 高永清 (天安药业股份公司，天津，300171) 摘 要 介绍了两种无需衍生就可直接进行氨基酸分析的新型检测技术，并与柱前、柱后衍生氨基酸分析方法作了比较。 关键词氨基酸分析斤检测技术柱前、柱后衍生 前 言 近几年来，用液相色谱法分析检测氨基酸发展很快，尤其是各种柱前和柱后衍生方法的发展较大地改进了液相色谱法的选择性和灵敏度，使之适用于不同的分析对象。 自上世纪九十年代以来，各种柱前衍生法的应用已趋于成熟，主要是针对各种衍生试剂的研究与开发，相继推出了诸如：邻苯二甲醛法(OPA)、丹酰氯法(DANSYL-Cl)、二甲胺偶氮苯磺酰氯法(DABSYL-CI)、氯甲酸芴甲酯法(FMOC-Cl)、异硫氰酸苯酯法(PITC)、二硝基氟苯法(FDNB)和琥珀酰亚胺基甲酸酯法(AQC)1-91。这些方法的优缺点、检测限及对各种氨基酸的分离情况等，有关文献已经做了评述，本文不再讨论。本文着重介绍两种新型检测技术在氨基酸分析中的应用，并将这两种新检测技术与现用的柱前、柱后衍生氨基酸分析方法作了比较。 2 积分脉冲安培检测技术(IPAD) 由于大多数氨基酸不具备生色团，因此无法利用分光光度法直接检测，故需采用化学衍生技术，使之生成可在紫外或可见光区有吸收的化合物，或者采用荧光法检测。但对于色谱工作者来讲，尤其是在新药研制的过程中，面对多种未知的降解物，如采 用紫外等检测器，需事先用纯品定性，并求得各组分的响应因子后方能定量。这样，就产生两个问题，一是降解物纯品难以获得；二是无紫外生色团的物质需经化学反应产生生色团，就不可避免地出现反应产物的多样性。因此，经过衍生再进行分析，很难判断降解物的来源，故非常需要不经衍生就能直接检测各组分的通用型检测器。 在氨基酸的分析中，如采用不经衍生就能直接检测的技术，可避免定量衍生中一级氨和二级氨衍生化产物不同，以及衍生化产物不稳定等带来的问题。戴安公司(DIONEX)近年推出的氨基酸直接分析系统(AAA-Direct)，基本上满足了这些要求。 用 AAA-Direct 分析氨基酸时，无需柱前或柱后衍生，只需将样品稀释到一定程度后直接进样，色谱柱选用薄壳型阴离子交换树脂为填料，检测器使用脉冲积分安培检测器(IPAD)，可以对一级氨和二级氨同时进行检测。这一方法避免了上述诸多问题，其分析原理是：氨基酸是两性分子，在强酸性介质中以阳离子形式存在，可用阳离子交换分离；在强碱性介质中以阴离子形式存在，可用阴离子交换分离。色谱柱填料采用新的薄壳型阴离子交换树脂，样品经阴离子交换分离后，用IPAD 对阴离子进行检测，通过优化流动相的 pH和浓度，可使各种氨基酸获得良好分离和检测。 采用 AAA-Direct 对本公司的18种氨基酸输液 图2 18种氨基酸葡萄糖注射液的谱图 目前使用的氨基酸分析仪，均采用柱后衍生方法，衍生剂为邻苯二甲醛(OPA)或茚三酮。当用OPA 作衍生剂时，需使用荧光检测器，其分辨率和灵敏度均较高，但OPA 不能与二级氨起反应，需先用次氯酸氧化后再进行衍生，但胱氨酸和赖氨酸的信号较弱，且不能同时测定色氨酸。当用茚三酮衍生时，一级氨产物为兰紫色，而二级氨为黄色化合物，故只能用双通道紫外检测器同步检测。同时，衍生条件要求高，需增设加温衍生装置。柱后衍生由于本身方法的原因，多为在线衍生，因而仪器的结构复杂，用途单一，操作繁杂，造价昂贵。有些流动相或衍生剂需从国外进口，且消耗量大，每个月成本需数万元。对于色氨酸，有时根本无法测定。 与柱前衍生方法和氨基酸分析仪比较，氨基酸直接分析系统(AAA-Direct)具有很多优点： (1)无需柱前、柱后衍生，可直接进样。 (2)一次进样可分析氨基酸、氨基糖和碳水化合物。 (3)采用直接阴离子交换，积分脉冲安培检测，分离效果良好，具有较高的灵敏度与准确度。灵敏度与茚三酮荧光检测法相当，可达 pmol级。亮氨酸：4.42pmol；异亮氨酸：2.84pmol；脯氨酸：1.29pmol；缬氨酸：1.48pmol；甲硫氨酸：1.12pmol，其余氨基酸均在 1pmol 以下。线性范围比较宽，对 样品无特殊要求，对水解氨基酸也可进行测定。 (4)仪器设备结构比较简单，色谱柱价格远低于一般氨基酸分析仪所用色谱柱的价格。 (5)试剂简单、价廉，如：以NaOH、NaAC 为流动相，可以自己配置，无需进口，日常费用相当低廉。 (6)对于柱前柱柱后衍生法较难分离的胱氨酸与酪氨酸、缬氨酸与蛋氨酸、脯氨酸、异亮氨酸与亮氨酸等，用AAA-Direct 均可获得基线分离。 4 蒸发光散射检测技术 蒸发光散射检测技术的工作原理是：经色谱柱分离的组分与洗脱液进入喷雾器，用空气或氮气流雾化，再流经可控温的蒸发器，使溶剂蒸发，而组分成为微小的颗粒，让它们高速通过蒸发柱及光源光路，在其穿过光路时导致光散射，散射光可用光电倍增管收集，从而得到样品信号。如果流动相恒定流速不变，散射光通量与流通池中组分的量成正比。因此，如用光散射技术进行检测，样品无需具备紫外发色团和合适的折光率，并且该检测法对梯度洗脱和流动相系统温度变化不敏感，是一种真正的通用型检测器。该检测器对被分析组分或杂质均有响应，且响应因子基本相同。 目前，这一检测技术已经在药物分析、生化物质测定、高分子分析、表面活性剂等方面得到广泛应 用。Bongiouanni R 用这种检测器对8种必需的氨基酸进行了定量分析[10，11)，一次进样，不经衍生，获得了良好的结果。同时还用这种检测技术检测几种未衍生化的小肽，也同样获得良好结果。 由此可看出，蒸发光散射检测技术与 HPLC联用于测定氨基酸，具有明显的优点： (1)灵敏度高，可消除溶剂等的影响。 (2)对流动相系统温度变化不敏感，可进行梯度洗脱。 (3)可扩大液相色谱的应用范围，能消除杂质和流动相的紫外吸收干扰。 (4)无需测定校正因子就可进行定量分析。 (5)分析氨基酸无需柱前、柱后衍生，可一次进样进行测定。 本文介绍的两种检测技术与 HPLC结合用于氨基酸分析，不但促进了液相色谱法的发展，而且还 给液相色谱法提供了许多功能，使其应用范围不断扩大，同时对于氨基酸分析技术的发展也有良好的促进作用。 ( 参考文献 ) ( 1 刘惠文.氨基酸和生物资源，1995，17(2)：50~55 ) ( 2 常碧影等.分析化学， 1993，21(10)：1220-1 2 27 ) ( 3 朱曙东.色谱，1994，12(1)：20~23 ) ( 4 杨岗等.中国医药工业杂志，1993，24(5)：216~218 ) ( 5 陈娅兰等.药 物 分析杂志，1990，10(3)：149-151 ) ( 6 夏柳影等.药物分析杂志，1990，10(2)：68~72 ) ( 7 赵秋雯等.分 析 化学，1990，18(11)：1038-1040 ) ( 8 郭燕捷等.色 谱 ，1989，7(4)：219~ 2 21 ) ( 9 张叔良.色谱，1993，11(1)：17~22 ) ( 10 B ongiouanni R.药物分析杂志，1 9 94，14(5)：62~63 1 ) ( Bongiouan n i R.药物分析杂志，1994，14(6)：51~52 ) ( 12 Waters公司.液相色谱通讯，第34期：2~4 ) ( 收稿日期：2002-08-28 ) ( Two methods f or direct analysis of amino acid s . Gao Yongqin g (Tianan Pharmaceutica l Co . Ltd， Tianjin ，300171) ) ( T wo m e thods fo r an a lysis o f a m ino ac i ds wi t hout th e ne e d of de r ivation ar e de s cribed a n d ha v e be e n compared with p re-colamn a nd p ost-colamn methods. )