陈醋中有机酸检测方案

Shanghai Nano Industrial Co.，Ltd.※分析检测 (纳诺仪器nano instrument※分析检测食品科学 山西老陈醋中有机酸的HPLC测定分析 吕利华1，梁丽绒2，赵良启1，* (1.山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原 0300062.太原市疾病预防控制中心，山西太原 030001) 摘 要：本实验建立了采用离子排斥色谱法快速测定山西老陈醋中的8种主要有机酸的方法。选用PRP-X300离子排斥色谱柱，确定最佳色谱分离条件为：0.05mmo1/L H2S04为流动相，流速1ml/min， 柱温为室温，紫外检测器，检测波长为210nm，进样量5u1。各有机酸的相对标准偏差为0.72%~5.47%，回收率达到95.1%~105%。该方法具有简便快速、选择性好、准确度高的特点。 关键词：离子排斥；山西老陈醋；有机酸；高效液相色谱 Determination of Organic Acids in Shanxi Ageing Vinegarby High Performance Liquid Chromatography LU Li-hua， LIANG Li-rong’， ZHAO Liang-qil* (1.Chemical Biology and Molecular Engineering Laboratory of Education Ministry， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；2.The Center for Disease Control and Prevention of Taiyuan， Taiyuan 030001， China) Abstract： An ion-exclusion HPLC method for rapid determination of 8 organic acids in Shanxi ageing vinegar was developedin this paper. 8 organic acids were separated by the use of PRP-X300 ion-exclusion column， and the optimal separationconditions are as follows： 0.05mmol/L HSO4 as mobile phase，flow rate at 1ml/min， column temperature at room temperature，UV detector at 210 nm， and sample size as 5 u 1. The RSD is 0.72%~5.47%， and the recovery rate is 95.1%~105%. The methodhas the advantages of rapid and simpleoperation， good selectivity and high accuracy. Key words： ion-exclusion Shanxi ageing vinegar； organic acid； HPLC 中图分类号： TS201.2 文献标识码A 文章编号：1002-6630(2007)11-0456-04 山西老陈醋是我国的四大名醋之一，其历史悠久且品质优良，在国内外享有盛誉。由于山西老陈醋独特 ( 1 MERKEN H M， BEECHER G B . Liquid c hromatographic method for theseparationand quantification flavonoides[J].JChromatographyA， 2000，897：177-184. ) ( 2 JUSTESEN U J， K NUTHSEN P . C omposition of flavoniods in fresh herbs andcalculationof flavoniod intaked byuseofherbs in traditionalDanishdishes[J]. Food Chemistry， 2001 ， 73：245-250. ) ( 3 CHEN H ， Z UO Y G， D ENG Y W. Separation and determination of flavonoids and other p h enolic compounds in cranberry juice by high- performance liquid chromatography[J]. J o urnal o f Chromatography A， 2001，913：387-395. ) ( 4 张玉潜，陈充，孙效东. PR-HPLC法同时测定依普黄酮及其代谢物M-i血浆浓度及药代动力学研究[J].药物分析杂志，1997， 17(3)： ) ( 150-151. ) ( 5 NUUTILA A M ， KAMMLOVIRTN K， O K SMAN-CALDENTEYYI M. Compounds of methods for the hudrolysis o f f l avoids and phenlicacid from onion and spinach for HPLC analysis[J]. Food Chemistry， 2002，76：519-525. ) ( 6 邹耀洪，李桂荣.反相高效液相色谱分析杨梅叶中抗氧化成分黄酮 类 化合物[J].分析化学，1998，26(5)：531-534. ) ( 7 吴惠勤，程青，张桂英，等.南雄银杏叶中银杏黄酮含量的HPLC测定[J].分析测试学报，2001，20(6)：53-54. ) ( 8 MARKHAM K R ， PORTER L J . A n i ncrease in the Luteotin： a p igeninratio in Marchantia Ploymorpha[J]. Phytochemistry， 1998，48(5) ： 791-794. ) 西老陈醋的品质和特征，是评价山西老陈醋质量的重要指标。 山西老陈醋的味感，主要是由有机酸、糖分、氨基酸等成分决定的，其中有机酸是山西老陈醋中最主要风味物质，有机酸的种类、含量及其相互比例与产品质量密切相关。建立山西老陈醋有机酸成分的测定与分析方法，不仅有利于成品醋的质量鉴定与评价，以便辨别真伪，规范市场，而且有利于提高老陈醋生产过程的技术管理水平，增加优质老陈醋的出品率。 近年来不断有文献报道用高效液相色谱法测定食品中有机酸含量，但报道较多的是酒中有机酸的测定。而对食醋中有机酸分析的报道极少，更没有关于山西老陈醋有机酸测定的文献报道。这主要是由于山西老陈醋的有效成分复杂，有机酸种类繁多，且某些有机酸(如乙酸、乳酸)的含量至少是其他有机酸含量的十几倍，使得其他微量有机酸无法分析检测。另外，山西老陈醋由于其特有的原料配比和熏酿造工艺，使得其中的色素含量远远高于其他同类产品，干扰因素极多，因此分析山西老陈醋的有机酸组分十分困难。 本研究建立了先利用C18固相萃取小柱对山西老陈醋样品进行预处理，而后采用离子排斥高效液相色谱法对其有机酸成分进行分析测定的方法。该法具有分析速度快、结果准确度高、检测组分多等特点，有较好的应用前景。 1 材料与方法 1.1 样品 瑞福莱、 宁化府、来福、水塔、东湖、四眼井六个品牌的市售山西老陈醋，分别编号为1~6号醋样品。 1.2 主要试剂 色谱纯甲醇、优级纯硫酸、超纯水；分析纯标准品：：甲酸、乙酸、乳酸、草酸、酒石酸、苹果酸、丙酮酸、柠檬酸。 1.3 仪器及设备 1525型高效液相色谱仪(美国waters公司)；2487型双波长检测器；PRP-X 300(7u m， 250mm ×4.6mm)离子排斥色谱柱(美国)；Symmetry Ci(5u m， 250mm×4.6mm)色谱柱(美国)；C18固相萃取预柱(500mg/5ml)；Mili-Q超纯水制备仪；真空脱气机。 1.4 方法 1.4.1 有机酸标准液的配制 分别称取适量上述有机酸标准品，用超纯水溶解并定容至100ml，保存于4℃冰箱中。使用时分别稀释成不同质量浓度的标准溶液(见表1)。 1.4.2 样品预处理方法 表1 有机酸标准浓度系列(g/100ml) Table 1 Series concentrations of standard organic acids(g/100ml) 巧2 山西老陈醋色素含量高，不仅干扰有机酸的测定，而且严重污染色谱柱。本实验采用下面的预处理方法：把山西老陈醋样品用0.20mol/L K2HP04缓冲溶液稀释至适当浓度后(使有机酸解离而不被非极性的C18预柱吸附)，用0.45um滤膜过滤后，取5ml滤液以1ml/min流速流经C18固相萃取预柱(使用前用甲醇活化，活化方法见参考文献[2，3])除去色素干扰物，弃去最初流出的2ml， 收集其后流出液3ml，备用。 1.4.3 色谱条件 色谱柱PRP-X 300离子排斥柱(7um， 250mm×4.6mm)；检测器紫外检测器；检测波长210nm；流动相 0.05mmol/L 硫酸溶液(0.45um醋酸纤维素滤膜过滤，超声波脱气15min)；流速1ml/min；柱温室温；进样量 5u1。 1.4.4 有机酸定性定量方法 在上述色谱条件下进样，测定各标准品的出峰时间，而后以样品中各有机酸的保留时间与标准品保留时间相比对后定性。 在上述色谱条件下，不同浓度的有机酸标准液(标准样品浓度见表1)分别进样，以峰面积外标法定量，计算各有机酸的标准曲线方程。 2 结果与分析 2.1 样品预处理方法选择 标准品配制一定浓度的有机酸溶液，用0.20mol/LK2HP04缓冲溶液稀释2倍、稀释5倍、稀释10倍和稀释15倍后再经C18预柱处理，液相色谱检测处理前后有机酸浓度有无变化。实验结果显示，用C18预柱处理有机酸溶液时，有机酸在过柱前后浓度无变化，证明C18预柱不会吸附其中的有机酸，可采用此方法进行山西老陈醋样品的预处理。 对于山西老陈醋样品的预处理方法，我们分别选择了样品用0.20mol/L KHP04缓冲溶液稀释2倍、稀释5倍、稀释10倍和稀释15倍后再进行C18预柱处理。实验结果表明，样品用0.20mol/L KHP04缓冲溶液稀释10倍后再用C18预柱吸附其中的色素，处理效果良好，处理后样品呈无色透明状，适合于液相色谱分析使用。 2.2 检测波长的选择 在紫外波长200~240nm处对老陈醋中包含的各种有机酸的标准品溶液进行吸光度扫描，发现各种有机酸在人=210nm左右均有较大吸收峰，因而将紫外检测波长定为210nm。 2.3 色谱柱的选择 2.3.1 Symmetry Ci柱(5u m， 250mm×4.6mm) 对于有机酸的分离，目前国内使用键合十八烷基填料(Ci8)色谱柱的较多，因而我们选用了 Symmetry Ci8色谱柱，对其流动相甲醇-0.10mol/L KHP04溶液的有机改性剂甲醇的含量、pH值、流速等条件进行了多次实验，均未达到满意的分离效果。图1为选用5%CH30H-0.10mol/L KH2P04(pH3.0)溶液为流动相，流速为1.0ml/min， 进样量为5u1时有机酸标准品混合液的液相色谱图，从图中可以看出，尽管该色谱条件下各有机酸的标准品可以得到一定程度的分离，但出峰时间间隔很短，若对山西老陈醋中的有机酸进行分析，由于乙酸和乳酸在样品中含量很高，必定会造成其它有机酸的峰被乙酸或乳酸峰掩盖。且国外也有文献报道C18色谱柱不能完全分离多种有机酸4]。因此，我们认为C18柱不适合山西老陈醋中有机酸的分析测定。 图1 有机酸标品的Ci8液相色谱图 Fig.1 Chromatogram of a mixture of organic acids standardsusing Cis column 2.3.2 PRP-X300离子排斥柱(7u m， 250mm ×4.6mm) PRP-X300离子排斥柱的的流动相一般是0.05mmol/L的H2S04溶液，柱温为室温。我们对最佳流速和进样量进行了选择：分别以流速0.5、0.6、0.8、1.0、1.2ml/min， 进样量为5、10、15u1进行分离效果实验。结果表明流速为1.0ml/min，进样量为5u1时有机酸的混和标准液得到较好的分离，同样采用该色谱条件分析山西老陈醋样品，也取得了很好的分离效果，如图2所示。 2.4 各种有机酸的定性与定量实验 2.4.1 定性实验 定性测定结果表明，老陈醋含有10种有机酸(见图 图2 老陈酸样品的离子排斥色谱图 Fig.2 Chromatogram of organic acids in Shanxi ageing vinegrusing ion-exclusion column 1)，按出峰时间顺序依次为：草酸、未知酸1、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、、甲酸、柠檬酸、乳酸、未知酸2、乙酸，各酸保留时间见表2。 表2 各种有机酸的保留时间(min) Table 2 Retention time of each organic acid(min) 酸名称 草酸酒石酸 丙酮酸 苹果酸 甲酸柠檬酸 乳酸 乙酸 序号 1 3 4 5 6 7 8 10 保留时间1.7622.262 2.747 3.345 3.612 4.400 6.191 8.042 注：其中峰②和峰⑨为未知峰，尚需采用液-质联用仪进行定性检验。 2.4.2 定量实验(面积外标法) 将不同浓度有机酸标准液从低浓度到高浓度依次进样，计算各自的峰面积(每个样平行进样三次)。按实验结果制作各种有机酸的标准曲线，计算回归方程(见表3)。 表3 各种有机酸的回归方程、相关性系数与检出限 Table3 Regression equation， correlation coefficient anddetermination limit of each organic acids by this method 组分 回归方程 相关系数 检出限(mg/100ml) 草酸 Y=4.0001×10-6X 0.9928 0.005 酒石酸 Y=2.1105×10-X 0.9989 0.013 丙酮酸 Y=2.5771×10-X 0.9907 0.013 苹果酸 Y=4.1612 ×10-X 0.9983 0.049 甲酸 Y=3.7493×10-6X 0.9999 0.044 柠檬酸 Y=2.3799×10-6X 0.9983 0.016 乳酸 Y=8.2124×10-6X 0.9995 0.030 乙酸 Y=6.2015×10-X 0.9999 0.039 2.5 方法的精密度与重现性 将山西老陈醋1号醋样品重复进样测定五次以考察方法的重现性，测定结果见表4。 由表4可知，各有机酸的相对标准偏差在0.72%~5.47%之间，重现性较好。 2.6 方法的回收率 在3号老陈醋样品中加入各种标准有机酸，进行高 表4 方法的重现性实验结果(g/100ml) Table 4 Result of accuracy experiences of this method (g/100ml) 测定次数 草酸 酒石酸 丙酮酸 苹果酸 甲酸 柠檬酸 乳酸 乙酸 1 0.1627 0.1514 0.5296 0.3506 0.1458 0.2251 3.6103 5.0097 2 0.1644 0.1523 0.5410 0.3578 0.1503 0.2184 3.6270 5.1054 3 0.1600 0.1503 0.5386 0.3546 0.1577 0.2199 3.6354 4.9940 4 0.1597 0.1536 0.5299 0.3485 0.1395 0.2300 3.5918 5.1101 5 0.1605 0.1488 0.5401 0.3339 0.1383 0.2297 3.5729 5.0442 平均值 0.16146 0.15128 0.53584 0.3501 0.14632 0.22462 3.60748 5.05268 标准偏差 0.00202 0.00184 0.00563 0.00717 0.00801 0.00538 0.02554 0.05348 相对标准偏差(%) 1.25 1.22 1.05 2.05 5.47 2.40 0.71 1.06 表6 各种山西老陈醋中有机酸的含量表(g/100ml) Table 6 Content of each organic acid in different Shanxi ageing vinegar samples (g/100ml) 醋样品编号 草酸 酒石酸 丙酮酸 苹果酸 甲酸 柠檬酸 乳酸 乙酸 1号醋样 0.1610 0.1514 0.5387 0.3507 0.1456 0.2272 3.5832 5.0082 2号醋样 0.1785 0.1039 0.4962 0.2919 0.0988 0.0132 1.8075 5.4835 3号醋样 0.1272 0.0602 0.3753 0.1434 0.0648 0.2234 2.2533 4.2668 4号醋样 0.1120 0.0628 0.1887 0.1431 0.0719 0.2616 1.4557 4.9328 5号醋样 0.1258 0.0283 0.1614 0.1226 0.0663 0.1123 1.3123 4.4360 6号醋样 0.1562 0.1378 0.4089 0.2338 0.0856 0.1166 2.4186 5.4053 相液相色谱法测定，计算回收率。结果见表5。 从表3可以看出，回收率为95.1%~105%，证明该方法的准确性较高，完全适用于老陈醋中有机酸的检 表5 方法的回收率实验结果(g/100ml) Table 5 Recovery rate of each organic acid by this method(g/100ml) 组分 醋样含量 醋样与标准品总量 加入标准品量 回收率(%) 草酸 0.1272 0.4601 0.350 95.1 酒石酸 0.0602 0.1786 0.120 98.7 丙酮酸 0.3753 0.8952 0.530 98.1 苹果酸 0.1434 0.5822 0.460 95.4 甲酸 0.1456 0.4848 0.350 96.9 柠檬酸 0.2234 0.7054 0.500 96.4 乳酸 2.2533 4.3035 2.010 102 乙酸 4.2668 6.4193 2.050 105 测分析。 2.7 老陈醋样品中有机酸的测定结果 分别取各种山西老陈陈进行样品处理后，进样5u1，以峰面积外标法定量，三次测定结果的平均值见表6. 3 讨 论 山西老陈醋由于其特有的原料配比和熏酿造工艺，使得其中的色素含量远远高于其他同类产品，且其成分复杂，干扰因素极多，因此分析山西老陈醋的有机酸组分十分困难。本研究选用C18固相萃取小柱对山西老陈醋样品进行预处理，在不吸附样品中的有机酸的前提下，成功地去除了老陈醋样品中的色素。在此 基础上，又选用离子排斥色谱分析柱对老陈醋中的8种有机酸组分进行了定性、定量测定，取得了较好的分析结果。 本实验建立的有机酸离子排斥色谱分析法简便、快速、准确，不仅适用于山西老陈醋样品中有机酸的分析，也可用于其他调味品中有机酸的分析。但是，要确定山西老陈醋中各种有机酸的含量及其相互比例与山西老陈醋的质量之间的关系，还需要将分析测定数据与专家品评结果相结合，再通过一定的数理方法与统计学软件(例如模糊综合评判法、SPSS软件等)分析处理并且与老陈醋的其他香气、香味成分含量综合比较后方可确立下来。本实验仅为建立山西老陈醋质检标准提供一定的技术依据。 ( 参考文献： ) ( 1 王立，汪正范.色谱分析样品处理[M].北京：化学工业出版社，2001： 85-93. ) ( 2 毕丽君，顾振宇.固相萃取一反相HPLC分析色酒中有机酸[J].理化检验：化学分册，2004(4)：163-165. ) ( 3 任一平，高宗裕，黄百芬.高效液相色谱法测定黄酒中的有机酸[J].食品与发酵工业，1991(5)：41-45. ) ( 4 SUAREZ-LUQUE S ， MATO I . Rapid determination of minority or-ganic acids in honey by high-performance liquid chromatography[J].Chromatogra， 2002，955：207-214. ) ( 5 张军，韩英素，高年发. HPLC法定定葡萄酒中有机酸的色谱条件研究[J].酿造科技，2004(2)：91-93. ) ( 6 郭德华，夏琳.离子排斥色谱法同时测定果汁中11种有机酸[J].色谱，2001(5)：276-278. ) ( 7 L ODI S， ROSSIN G. Determination of o rganic a cids in sugar factory nroductsI.Tl Chromatoora 1995 706.375-383 ) 免费服务热线：4009-217-117 爱仪器要仪器 O China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net