中药中有效成分含量分析检测方案

中莱材 Joumnal of Chinese MedicinalMaterials 第33卷第4期2010年4月·532· 3.4 尽管本实验图谱中标示出的3个峰为山茱萸的主要成分莫诺苷、马钱素、山茱萸裂苷)，但有些相对明显的峰还是未知成分，如出峰时间为21.7m in及 43.8min左右的峰。这些需在以后的研究中进一步完善。 3.5 采用 HPLC法，以山茱萸的主成分莫诺苷、马钱素及山茱萸裂苷为指标而建立的指纹图谱可有效 控制山茱萸药材的质量，方法简便、准确，重复性较强。 ( 参 考 考 文 献 ) ( [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2005：20. ) ( [2]袁国卿.八大宛药"的历史形成[J].时珍国医国药， 2009，20(1)：142-143. ) 广东从化桑寄生药材的HPLC指纹图谱研究 曹越，彭维”，苏薇薇”，罗颂平* (1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州510405；2.中山大学生命科学学院，广东广州510275) 摘要 目的：建立桑寄生药材的 HPLC指纹图谱。方法：采用高效液相色谱法，用95%乙醇超声提取加水浴回流的混合提取方法制备样品，流动相：乙腈(A)：(0.05 mol/L) KH， PO4-H， PO缓冲溶液 pH=3.0(B)，线性洗脱梯度，洗脱程序如下：0~65min乙腈10%一28%，65~85min乙腈28%→52%。检测波长：220 mm；流速：1.0mL/m in。结果：分析了10批不同采摘时间的广东从化桑寄生药材，建立了桑寄生药材的 HPLC指纹图谱，确立了16个共有峰，并且利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件"对不同样品之间的相似度进行计算。结论：该方法准确可靠，重复性好，为桑寄生药材的质量控制提供科学准确的依据。 关键词桑寄生；高效液相色谱；指纹图谱 中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1001-4454(2010)04-0532-04 桑寄生为桑寄生科植物桑寄生 Taxillus chinen-sis(DC.)Danser的干燥带叶茎枝，又称寄生、桑上寄生，为常绿寄生小灌木。主产于福建、广东等地。具有补肝肾、强筋骨、养血安胎的功效。临床上常用于治疗肝肾虚亏、冲任不固所致胎漏下血、胎动不安，常与续断、菟丝子、阿胶等配伍。 桑寄生药材主要来源于植物桑寄生和檢寄生两种，两种为不同植物，其药用的有效成分也相差较大，因此桑寄生的药用疗效也有较大差异日。目前广州市售的桑寄生药材大多为桑寄生与檞寄生的混合品，较少见到单一来源于植物桑寄生的药材。 对桑寄生研究的文献较为多，多数为桑寄生药材与檞寄生药材的比较，也包括采用高效液相法对桑寄生与檞寄生药材的比较，但叙述较为简略，成分单一，批次也过少④。为避免不同品种所造成的成分差异，本研究对产自广东从化的10批桑寄生药材进行检测，以芦丁、槲皮苷、榭皮素为特征成分，拟建立其特征指纹图谱。 材料与仪器 1.1 材料 10批桑寄生药材均产于广东从化，采集时间不同。批号分别为080928、080918、081008、081029、081021、080629、080627、080416、080513、080712。经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波副教授鉴定，均为桑寄生科植物桑寄生 Taxilluschinensis (DC.) Danser的干燥带叶茎枝。芦丁(批号：：100080-200707)、槲皮苷(批号：：111538-200403)、榭皮素(批号：100081-200406)对照品均由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯，磷酸、甲醇为分析纯，水为超纯水。 1.2仪器 戴安 Dionex公司高效液相色谱仪 (ASI100自动进样器、ATH-58柱温箱、P680四元梯 度泵、PDA-100检测器)。 2方法与结果 2.1色谱条件色谱柱： Agilent HC-Cig Analytical(250 mm ×4.6 mm，5卜m)；检测波长：220 mm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；分析时间 85 m in；进样量 10u L；流动相：乙腈(A)：(0.05 mol/L) KH， PO4-H， PO4缓冲溶液 pH=3.0(B)，线性洗脱梯度，洗脱 ( 收稿日期：2009-07-30 ) ( 基金项目：国家自然科学基金项目(30772819) ) ( 作者简介：曹越(1983-)，女，博士研究生，主要从事中医妇科学研究； Tel： 020-36587449， E mai l ： chouyu936@126. com。 ) ( 通讯作者：罗颂平， Tel： 020-36587449， E mail： songp ingluo@ hotmail . com。 ) 程序如下：0~65 min乙腈 10%一28%，65~85min乙腈28%→52%。 2.2供试品溶液的制备精精密称取桑寄生药材粉末过2号筛，内孔直径 850 ±29pm，24目)1g，以95%的乙醇(10mL)浸泡 30 m in，超声提取两次，每次 30 min，过滤，合并滤液，得醇提液。将药渣在水浴上挥干溶剂至无醇味，加入蒸馏水(10mL)浸泡30 min，100℃水浴加热回流提取两次，每次 30 m in，过滤，合并滤液，得水提液，合并醇提液及水提液，减压回收溶剂至近干，加甲醇30mL超声处理 30 m in，过滤，滤液蒸干后加甲醇定量转移至5mL容量瓶中，放置过夜，置茄形瓶中，减压蒸干，加水5~10mL定量转移至固相萃取小柱(SPE柱)，15mL水洗涤茄形瓶及固相萃取小柱，加甲醇30mL洗脱茄形瓶及固相萃取小柱，收集洗脱液，减压蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至 5mL，用 0.45um的微孔滤膜滤过，备用。 2.3对照品溶液的制备 分别精密称取芦丁、槲皮素、榭皮苷对照品适量，用甲醇溶解，配成浓度均为 1mg/mL的对照品溶液。 方法学考察 2.4.1 重现性试验：取同一批次桑寄生药材(批号：080629)6份，按"2.2"项下方法制备供试品溶液，依次测定，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。计算相对保留时间和相对面积RSD均小于 3.0%，结果表明该方法具有良好的重现性。 2.4.2精密度试验：取同一份供试品溶液，连续进样6次，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。计算相对保留时间和相对面积 RSD均小于 3.0%，结果表明仪器精密度符合要求。 2.4.3稳定性试验：取同一供试品溶液(批号：080629)，分别在 0、2、4、8、12、16、20、24h内进样，记录各共有色谱峰的保留时间和面积，通过计算相对保留时间和相对面积 RSD均小于 3.0%，结果表明常温下供试品溶液在24h内保持稳定。 2.5桑寄生药材高效液相指纹图谱的建立取10批桑寄生药材，按“2.2"项下方法制备供试品溶液，按“2.1"项下色谱条件进行测定，将10批样品的数据采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A版》进行评价，确立了16个共有峰，指纹图谱见图1，叠加图见图2，相似度评价结果见表1。 9.芦丁11.檞皮苷 15.桷皮素 选择11号峰檞皮苷为参照峰(S)，各指纹峰的相对保留时间的 RSD值均低于 0.9%，但相对峰面积 RSD值都较大，各峰保留时间见表2、3。 图2 10批桑寄生药材指纹图谱色谱叠加图 S1~S10.1~10批桑寄生药材 R.共有模式图 表1 10批桑寄生药材的指纹图谱相似度 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 对照图谱 S1 1 0.912 0.938 0.965 0.918 0.912 0.938 0.965 0.912 0.918 0.962 S2 0.912 1 0.985 0.974 0.975 0.82 0.985 0.974 0.995 0.970 0.985 S3 0.938 0.985 1 0.978 0.973 0.985 0.857 0.978 0.985 0.973 0.990 S4 0.965 0.974 0.978 1 0.973 0.974 0.978 0.958 0.968 0.973 0.995 S5 0.918 0.975 0.973 0.973 1 0.975 0.973 0.973 0.936 0.965 0.986 S6 0.912 0.963 0.985 0.974 0.975 1 0.985 0.974 0.973 0.975 0.985 S7 0.938 0.985 0.976 0.978 0.973 0.985 1 0.978 0.985 0.973 0.990 S8 0.965 0.974 0.978 0.958 0.973 0.974 0.978 1 0.974 0.973 0.995 S9 0.912 0.995 0.985 0.974 0.975 0.976 0.985 0.974 1 0.975 0.985 S10 0.918 0.975 0.973 0.973 0.965 0.94 0.973 0.973 0.975 1 0.986 对照图谱 0.962 0.985 0.990 0.995 0.986 0.985 0.990 0.990 0.985 0.986 1 表2 10批桑寄生药材共有峰相对保留时间 批号 20080928200809182 200810082008102920081021 20080629 20080627 200804162008051320080712I RSD/% 1 0.2197 0.2197 0.2197 0.22 0.2192 0.2194 0.22 0.2191 0.2086 0.2209 0.1632 2 0.2906 0.2901 0.2902 0.2908 0.2897 0.2897 0.2901 0.2898 0.288 0.2897 0.2605 3 0.3122 0.3118 0.3119 0.3126 0.3114 0.3119 0.3118 0.3118 0.3199 0.3161 0.8716 4 0.5504 0.5497 0.5496 0.55 0.5507 0.5482 0.5475 0.5499 0.5498 0.5598 0.6147 5 0.583 0.5823 0.5823 0.5832 0.5827 0.5831 0.5825 0.5826 0.579 0.5825 0.2090 6 0.6 0.5989 0.5987 0.599 0.5998 0.6114 0.5983 0.5997 0.6 0.5993 0.6450 7 0.7805 0.7796 0.7798 0.7797 0.7792 0.7799 0.7792 0.7788 0.7798 0.7973 0.7165 8 0.8035 0.8029 0.8031 0.8031 0.803 0.8034 0.8023 0.8031 0.8046 0.8037 0.0768 9 0.9095 0.9091 0.9094 0.9095 0.9089 0.8906 0.9024 0.9094 0.9095 0.8942 0.7909 10 0.9603 0.9601 0.9605 0.9604 0.9603 0.9601 0.9597 0.9604 0.9607 0.9603 0.0289 11(S) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 12 1.0595 1.0592 1.0593 1.0593 1.0591 1.0591 1.0597 1.0599 1.0594 1.0592 0.0249 13 1.1126 1.1121 1.1125 1.1129 1.1121 1.163 1.1124 1.1128 1.1124 1.1135 0.1428 14 1.2942 1.2942 1.2945 1.2949 1.2943 1.2925 1.2947 1.2953 1.2943 1.2935 0.0610 15 1.5155 1.5152 1.5149 1.517 1.5158 1.513 1.5148 1.5167 1.5171 1.5104 0.1351 16 1.9077 1.9095 1.9085 1.9148 1.911 1.9135 1.9137 1.9131 1.914 1.9153 0.1430 r 0.9659 0.9659 0.9659 0.9654 0.9659 0.9685 0.9654 0.9602 0.9602 0.9592 一 3 讨论 影响。 3.1 供试品溶液制备方法的考察 3.1.1提取方式的考察：采用95%乙醇超声提取，蒸馏水水浴回流提取，95%乙醇超声提取合并蒸馏水水浴回流提取，95%乙醇超声提取液再用蒸馏水水浴回流提取四种方法的提取样品，结果以95%乙醇超声提取加蒸馏水水浴回流提取效果最好。 3.1.22提取时间及提取次数的考察：考察了超声30 m in、 1 h，水浴回流 30min、1h的提取效果，和提取次数对提取效果的影响，结果发现提取时间对其影响不大，但提取次数对药材提取效果有着较大的 总体分析比较发现选择以95%的乙醇(10mL)浸泡 30 min，以超声的方法先后提取两次，再用蒸馏水对醇提药渣水浴回流两次，每次提取 30 m in，提取效果最好。 3.2 色谱条件的选择 3.2.1流动相的选择：对比乙腈、甲醇的洗脱效果。通过色谱图可知乙腈的峰形比甲醇较好。因此选择乙腈为流动相的有机相。水、1%冰醋酸、0.03%磷酸、(0.05 mol/L) KH， PO4-H， PO4缓冲溶液进行洗脱的效果对比，根据流动相对色谱峰的分 批号 20080928 20080918 2008100820081029 20081021 20080629 20080627 200804162008051320080712I RSD/% 1 0.0574 0.1672 0.1776 0.1696 0.2465 0.3248 0.2222 0.1681 0.2973 0.2551 37.09 2 0.1258 0.4938 0.3248 0.2942 0.4217 0.9699 0.8183 0.2305 0.693 0.9353 57.26 3 0.0952 0.2255 0.147 0.256 0.6149 0.1381 0.1113 0.1694 0.4415 0.3022 66.12 4 0.0855 0.0908 0.1945 0.122 0.1557 0.1945 0.1473 0.226 0.0898 0.4565 62.42 5 0.1367 0.3266 0.5395 0.3228 0.3527 0.195 0.1664 0.7507 0.1093 0.6383 62.63 6 0.0431 0.0993 0.0786 0.0793 0.1019 0.2328 0.122 0.1242 0.096 0.2513 54.61 7 0.4672 0.9285 0.9985 1.0593 1.3255 0.2869 0.1084 1.5563 0.077 0.7429 67.38 8 0.0681 0.0864 0.0958 0.0877 0.1043 0.5092 0.3601 0.1436 0.0537 0.7493 14.77 9 0.0522 0.081 0.0961 0.0954 0.1129 0.1487 0.1134 0.1186 0.0928 0.1155 25.09 10 0.2702 0.3111 0.2965 0.3054 0.3332 0.2835 0.4955 0.3088 0.0449 0.6256 46.00 11(S) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 12 0.5472 1.2676 1.4259 1.4266 1.8191 1.2453 1.2345 1.8328 1.9345 1.4325 28.28 13 0.0559 0.1919 0.1475 0.2177 0.2627 0.4814 0.4214 0.1717 0.3831 0.2776 50.92 14 0.0831 0.196 0.1946 0.2856 0.3139 0.2542 0.1926 0.8539 0.3254 0.3209 69.00 15 0.0644 0.0914 0.0695 0.0922 0.1103 0.2029 0.1109 0.0873 0.047 0.3074 66.53 16 0.1454 0.0821 0.0278 0.037 0.0522 0.0535 0.1157 0.0696 0.0581 0.5926 13.66 离情况和色谱峰峰形，采用乙腈：(0.05mol/L)KH， PO4-H， PO缓冲溶液为流动相。由于样品成分多样，采用等梯度洗脱使较多的成分聚在一起，不易分离，因此根据样品成分特性，设置不同流动相梯度，以求达到更好的分离效果。经实验选择：0~65m in乙腈 10%一28%，65~85 min乙腈28%一52%为洗脱程序。 3.2.2 pH选择：样品的成分对 pH有较高的敏感性，因此实验对比了 pH 2.5、3.0、3.5的缓冲溶液，不同酸度会影响主要特征色谱峰的分离，因此优选pH=3.0磷酸盐缓冲溶液为流动相 B。 3.2.3 检测波长的选择：采用二极管阵列检测器(DAD)检测，全波长扫描分析，发现检测波长为220 nm时，各供试液所出的色谱峰较多，并且各色谱峰能够较好的分离，故选用 220 nm作为检测波长。 3.33综合分析桑寄生药材因其半寄生特性和寄主的多样性，质量控制较为困难，本研究采用的药材 原料为道地产区广东从化桑寄生，且寄主统一为桑树，并收集了不同采集时间的10批样本，通过全面系统的研究，制定反映其特征的指纹图谱。建立的指纹图谱具有稳定、重现性好的特点，同时将桑寄生指纹图谱与芦丁、檞皮苷、榭皮素的含量测定结合起来全面控制桑寄生药材的质量，本研究有助于桑寄生药材的标准化研究和质量控制，为其质量标准完善提供科学合理的依据。 ( 参 考 文 献 ) ( [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2005：210. ) ( [2]陈晓莹，谢斌.常用中药在治疗妇科疾病中的作用 [J].浙江中医药大学学报，2007，31(5)：796-797. ) ( [3]李永华，卢栋，朱开昕，等.对桑寄生使用混乱的分析 [J].广西中医学院学报，2007，10(2)：69-71. ) ( [4]董政起，朱静，金光株.HPLC指纹图谱鉴别桑寄生和槲 寄生[J].吉林中医药，2007，27(2)：56-57. ) ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. 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