近日,国家药品监督管理局发布了
修订《化妆品安全技术规范(2015年版)》中原有的5项检验方法,自2024年3月1日起,化妆品注册、备案及抽样检验相关检验应当采用新发布的检验方法。
新增14项检验方法,纳入《化妆品安全技术规范(2015年版)》,自通告发布之日起实施。
对应新的检验方法,今天给大家带来的是“化妆品中α-熊果苷等4种原料的检验方法”的数据分享。
使用CAPCELL PAK MGIII C18色谱柱可以得到α-熊果苷、β-熊果苷相对较好的分离,目标峰线性、回收率良好。
使用CAPCELL PAK ADME-HR色谱柱,对色谱条件做一些调整后,方法验证可得到良好分析结果,线性、回收率良好,同时α-熊果苷和β-熊果苷的分离度可达到3.58,并缩短了整体分析时间。
01
不同保留机理色谱柱的比较
首先使用不同保留机理的色谱柱对α-熊果苷和β-熊果苷的分离效果进行比较。
在常规C18体系下,CAPCELL PAK C18 MGIII可以得到较好的分离效果,而使用键合金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME-HR色谱柱,在相同液相条件下能得到更好的分离效果,分析结果如图1所示。
图1 C18 MGIII和ADME-HR色谱柱
α-熊果苷、β-熊果苷对照品分析结果对比图
【色谱条件】
色谱柱:CAPCELL PAK C18 MGIII S5;4.6×250
动动动动CAPCELL PAK ADME-HR S5;4.6×250
流动相:水 / 甲醇 = 95 / 5
流动速:0.5 mL/min
柱动温:20 °C
检动测:激发波长:292;发射波长:337
样动品:α-熊果苷20 μg/mL, β-熊果苷10 μg/mL (溶剂为甲醇)
进样量:5 μL
02
参考检验方法得到的结果
参考检验方法中推荐的色谱柱类型和规格,使用CAPCELL PAK C18 MGIII色谱柱对标准品、乳液样品和化妆水样品进行分析,可获得良好的分析结果。
图2 MGIII色谱柱分析结果-标准溶液
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
表1 MGIII色谱柱标准溶液积分结果表
【色谱条件】
色谱柱:CAPCELL PAK C18 MGIII S5;4.6×250
流动相:A,水;B,甲醇
B% 5%(0min)-5%(21min)-45%(22min)-50%(43min)-50%(48min)-100%(48.1min)-100%(50min)-5%(50.1min)-5%(60min)
流动速:0.5 mL/min
柱动温:20 °C
检动测:α-熊果苷、β-熊果苷的激发波长为292,发射波长为337;氢醌的激发波长为298,发射波长为345;苯酚的激发波长为:280,发射波长为318。
样动品:α-熊果苷2 μg/mL,β-熊果苷2 μg/mL,氢醌0.2 μg/mL,苯酚0.4 μg/mL (溶剂为甲醇)。
进样量:5 μL
标准曲线
用甲醇将固体标准品溶解稀释配制成标准工作溶液,浓度依次由低向高进样测定,以峰面积-浓度作图,绘制标准工作曲线。标准曲线在浓度范围内线性良好,线性系数r的范围为0.9997~1.0000,测试结果如表2所示。
表2 α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚的
线性方程、线性范围和相关系数
回收率
按照标准方法分别对化妆水和乳液样品进行加标回收实验,α-熊果苷和β-熊果苷添加量为20μg,氢醌添加量为2μg,苯酚添加量为4μg。对样品和加标样品进行分析,计算得到回收率结果,分析谱图如图4和图5所示。化妆水样品和乳液样品加标回收率范围为91.3%~108.9%,回收率良好。
图3 化妆水样品和化妆水加标样品分析图
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
图4 乳液样品和乳液加标样品分析图
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
【色谱条件】
色谱柱:CAPCELL PAK C18 MGIII S5;4.6×250
流动相:A,水;B,甲醇
B% 5%(0min)-5%(21min)-45%(22min)-50%(43min)-50%(48min)-100%(48.1min)-100%(50min)-5%(50.1min)-5%(60min)
流动速:0.5 mL/min
柱动温:20 °C
检动测:α-熊果苷、β-熊果苷的激发波长为292,发射波长为337;氢醌的激发波长为298,发射波长为345;苯酚的激发波长为:280,发射波长为318。
样动品:称取样品1.0 g(精确到0.001 g),置10 mL具塞比色管中,加入甲醇至10 mL,在涡旋混匀器上高速振荡30 s,使样品与提取溶剂充分混合。密塞,超声提取20 min,静置至室温,取适量样品溶液离心(转速14000 r/min)5 min,取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为待测溶液。必要时用适量甲醇稀释。
进样量:5 μL
03
使用CP ADME-HR的结果
基于α-熊果苷和β-熊果苷差向异构的化学性质,使用键合金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME-HR色谱柱,在检验方法的液相条件下能得到更好的分离效果,但保留时间较长,和氢醌峰接近,所以检验方法中的梯度条件不适合此款色谱柱。
尝试在检验方法的基础上对色谱条件进行调整,使目标峰能够获得更好的分离。
通过相应的方法学验证后,证实新方法下线性、回收率良好,同时α-熊果苷和β-熊果苷的分离度可达到3.58,并缩短了测试时间。
图5 ADME-HR色谱柱分析结果-标准溶液
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
表3 ADME-HR色谱柱标准溶液积分结果表
【色谱条件】
色谱柱:CAPCELL PAK ADME-HR S5;4.6×250
流动相:A,水;B,甲醇
B% 13%(0min)-13%(15min)-45%(15.1min)-49%(35min)-49%(36min)-100%(36.1min)-100%(40min)-13%(40.1min)-13%(50min)
流动速:0.5 mL/min
柱动温:30 °C
检动测:α-熊果苷、β-熊果苷的激发波长为292,发射波长为337;氢醌的激发波长为298,发射波长为345;苯酚的激发波长为:280,发射波长为318。
样动品:α-熊果苷2 μg/mL,β-熊果苷2 μg/mL,氢醌0.2 μg/mL,苯酚0.4 μg/mL (溶剂为甲醇)。
进样量:5 μL
标准曲线
用甲醇将固体标准品溶解稀释配制成标准工作溶液,浓度依次由低向高进样测定,以峰面积-浓度作图,绘制标准工作曲线。标准曲线在浓度范围内线性良好,线性系数r的范围为0.9998~0.9999,测试结果如表4所示。
表4 α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚的
线性方程、线性范围和相关系数
回收率
按照规范方法分别对化妆水和乳液样品进行加标回收实验,α-熊果苷和β-熊果苷添加量为20 μg,氢醌添加量为2 μg,苯酚添加量为4 μg。对样品和加标样品进行分析,计算得到回收率结果,分析谱图如图6和图7所示。化妆水样品和乳液样品加标回收率范围为88.4%~99.9%,回收率较好。
图6 化妆水样品和化妆水加标样品分析图
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
图7 乳液样品和乳液加标样品分析图
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
【色谱条件】
色谱柱:CAPCELL PAK ADME-HR S5;4.6×250
流动相:A,水;B,甲醇
B% 13%(0min)-13%(15min)-45%(15.1min)-49%(35min)-49%(36min)-100%(36.1min)-100%(40min)-13%(40.1min)-13%(50min)
流动速:0.5 mL/min
柱动温:30 °C
检动测:α-熊果苷、β-熊果苷的激发波长为292,发射波长为337;氢醌的激发波长为298,发射波长为345;苯酚的激发波长为:280,发射波长为318。
样动品:称取样品1.0 g(精确到0.001 g),置10 mL具塞比色管中,加入甲醇至10 mL,在涡旋混匀器上高速振荡30 s,使样品与提取溶剂充分混合。密塞,超声提取20 min,静置至室温,取适量样品溶液离心(转速14000 r/min)5 min,取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为待测溶液。必要时用适量甲醇稀释。
进样量:5 μL
结 论
综上,参考《化妆品安全技术规范 (2015年版)》第四章理化检验方法中8.2化妆品中α-熊果苷等4种原料的检验方法,使用CAPCELL PAK C18 MGIII S5;4.6×250色谱柱可以得到α-熊果苷和β-熊果苷较好的分离,目标峰线性和回收率良好。
使用CAPCELL PAK ADME-HR S5;4.6×250色谱柱,对检验方法进行调整后,可得到良好分析结果,线性和回收率良好,同时α-熊果苷和β-熊果苷的分离度可达到3.58,并缩短了测试时间。
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