纳米流式助力新冠病毒/疫苗快检，厦大颜晓梅团队Angew发布最新进展

截至2021年2月26日COVID-19新冠病毒累计感染超过1亿1千万人次，严重影响了世界人民生活、生产秩序。世界各国均加大了病毒疫苗的研发和生产投入，目前新冠疫苗的接种工作也在大规模进行中。灭活病毒疫苗由于其可靠的安全性、有效性而被广泛应用，例如，我国已经上市的国药集团和科兴中维两家新冠疫苗均是灭活病毒疫苗。

由于病毒的细胞培养物中通常含有细胞碎片、蛋白聚集体、病毒空壳、病毒缺陷颗粒、游离DNA等杂质，故需对疫苗进行纯化，生产出纯度高、安全有效的疫苗。而纯化过程中对病毒不同组分进行快速和可靠的检测，对病毒生产的上游工艺开发具有重要的指导意义。

近日厦门大学的颜晓梅教授团队在Angewandte Chemie（IF=13）上发表了对病毒滴度和纯度快速测定的新方法，文章通过纳米流式（nFCM）对T7病毒和病毒疫苗等进行测定，对病毒的不同组分进行精确分析，研究病毒生产纯化过程中病毒组分和纯度的变化，实现病毒疫苗生产过程的动态监测。

文中作者对T7病毒的不同组分进行分析，如下图，nFCM能够区分完整T7病毒、病毒空壳、游离DNA等组分，得到病毒各个组分的浓度和比例（图1）。同时测定过程中发现，完整T7的DNA强度和游离DNA强度有明显差异，但是游离DNA通过探测区的时间显著大于完整T7的DNA（图1f），表明游离DNA在溶液当中呈现“舒展”状态，而完整T7的DNA呈现“压缩”状态。分析发现它们峰积分却是一样的（图1e），说明完整T7和游离DNA的基因组大小一致，故而DNA荧光强度积分一致，显示出纳米流式在DNA测定的超高灵敏度和准确性。

图1  病毒组分的鉴定：完整病毒、空壳、游离DNA

病毒疫苗的生产步骤主要包括病毒接种、收获、纯化和乳化等过程。通过模拟病毒生产纯化过程，用纳米流式对猪流行性腹泻病毒（PEDV）和假狂犬病病毒（PRV）进行测定。结果显示在病毒粗提液中，完整病毒的纯度只有20%左右（图2bc），并且随着纯化次数的增加病毒纯度逐步上升（图2d），与传统WB和ELISA相比，纳米流式2-3min即可对病毒纯度进行快速检测，节省了大量时间和精力。

为了进一步验证nFCM在病毒定量方面的准确性，对rAD-EGFP载体和RPV疫苗进行了qPCR检测。结果显示在病毒载体和疫苗制剂中存在大量游离DNA和不具有感染能力的病毒颗粒，用nFCM测定的物理病毒滴度比用qPCR测定的病毒基因组滴度更接近空斑法测定的病毒活性滴度（Table 2）。值得指出的是，对于以灭活病毒为基础的疫苗，发挥抗原作用的是完整的病毒粒子，灭活前并不要求病毒是否具有传染性，与空斑法测定感染效价相比，nFCM对疫苗物理滴度的测定更有意义。

图2  病毒疫苗生产过程监测

表2 不同方法测定病毒滴度比较 

总的来说，基于纳米流式（nFCM）优越的灵敏度，通过散射光和荧光可实现病毒的高通量、快速检测，可应用于DNA，RNA，包膜和非包膜等病毒的工艺开发和生产过程中。除了核酸标记，纳米流式也可以对病毒表面蛋白、病毒膜、荧光修饰的病毒等进行检测，具有广泛应用前景。

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