冷冻电镜在膜蛋白结构研究中的应用、优势与展望——访荷兰格罗宁根大学cryo-EM负责人Cristina Paulino

在分子水平上，一个生物体的生理功能在很大程度上由它所表达的蛋白质决定，并且在大多数疾病病例中，蛋白质的功能失常往往是疾病的根本原因。

与传统的故障排查和维修一样，蛋白质的功能失常要找到问题根源进行修复，必须了解它是如何构建的，以及维持其各个功能的组件。而冷冻电镜技术（cryo-EM）正是可以帮助我们解读蛋白质等重要细胞机制的结构生物学。

近期，国外媒体采访了格罗宁根大学(University of Groningen) 结构生物学系高分辨率cryo-EM负责人Cristina Paulino（助理教授），请其介绍了cryo-EM在其团队研究膜蛋白结构和功能方面所发挥的重要作用。

媒体：研究膜转运蛋白的机制及结构的重要意义？您通常研究哪些特定类型的膜转运蛋白？为什么？

Cristina Paulino（CP）：获得结构性见解是解开蛋白质作用机制的基础。将蛋白质功能和生理数据相结合时，我们能够详细了解这些蛋白质如何运作，了解它们为什么以及如何发生故障，疾病的原因是什么以及我们如何解决它。我喜欢将蛋白质结构比作“组装机器的蓝图”。虽然遗传学和生物化学有助于理解蛋白质的生理作用，但结构生物学揭示了这些纳米机器的外观以及它们的连接方式。只有这样，我们才能理性地理解它们并利用这些知识来修复、设计或阻止它们。例如，基于结构的药物设计等。

我的研究重点是阐明嵌入膜中的蛋白质的作用机制，特别是膜转运蛋白和通道的作用机制。尽管膜蛋白具有高药理学相关性（目前超过60％市售药物的目标膜蛋白），但对膜蛋白的结构-功能-关系的研究还很少，需要生物学、化学和物理学等跨学科方法交叉研究。

虽然我的小组主要研究关于这些蛋白质如何发挥作用的基本问题，但研究结果可以带来额外的社会经济应用。这在我们对人类ASCT2的研究中得到证实，人类ASCT2是人体细胞中谷氨酰胺摄取的主要来源，与癌细胞生长，患者生存率低以及癌症治疗的新热靶点密切相关。除了解开其运输机制细节的工作外，我们还与药物化学家合作，以确定新的抑制剂并指导基于结构的药物设计。其他研究模糊了传统运输机制中存在的传统概念边界。例如，KdpFBAC复合物，即细菌中的紧急钾摄取系统，结合了主要活性转运蛋白和通道的特征。在TMEM16家族中，成员既可以作为钙激活的氯离子通道，也可以作为脂质打乱酶，甚至两者兼而有之。我们的研究表明，在进化过程中，保守蛋白结构不仅相互进化，而且可以融合在一起，以适应不同的环境和细胞需求。

TMEM16家族的膜蛋白研究成果发表在2019年3月12日的eLife期刊上的两篇背靠背论文中

媒体：cryo-EM对你工作的重要性如何？对团队能力提升有哪些影响？

CP：在过去几年中，cryo-EM已被证明是结构生物学中不可或缺的技术，提供了超过X射线晶体学的几个优点，即(i)只需要少量的蛋白质; （ii）不受蛋白质晶体形成的限制;(iii)几乎不受缓冲成分的限制，并允许在冻结前诱导构象变化;(iv)不受样本成分或构象异质性的影响，使我们得以一窥结构动力学; （v）能够确定低分辨率和高分辨率结构;(vi)允许使用模拟天然脂质环境的工具，如纳米盘。值得注意的是，虽然冷冻电镜获得的分辨率平均低于x射线晶体学，但对于膜蛋白获得的共同分辨率是相似的（约3-4埃）。事实证明，这些优势对于解决使用膜蛋白时面临的几个挑战至关重要，可以进行前所未有的研究，并使cryo-EM成为研究膜蛋白结构的首选技术。因此，cryo-EM是我们小组采用的主要技术。

媒体：使用cryo-EM推断一个膜蛋白结构的实验周期大概需要多久？

CP：在比较理想环境条件下，有一个比较理想的样品，一个性能良好的高端显微镜，有一套强大的图像处理集群，你可以在几天内解决一个高分辨率的结构。然而，在现实实验中，特别是在处理具有挑战性的膜蛋白时，时间周期通常是几周或几个月。

媒体:你最近用cryo-EM测定了TMEM16蛋白家族的结构。在新闻稿中，您声明这种方法“允许您对活动结构动态进行采样”。能详细谈谈吗?为什么cryo-EM优于其他可用的方法?

CP: cryo-EM的优点之一是样品经过震荡冷冻，保留了溶液中的所有构象。这与x射线晶体学形成了强烈的对比，x射线晶体学的定义是，晶体中的所有蛋白质都处于相同的状态，而这种状态通常局限于能量优先构象。此外，我们还可以在图像处理的层面上处理cryo-EM图像中存在的构象异质性。因此，我们可以从相同的样品中确定蛋白质在溶液中的几种结构，它们代表不同的功能状态。在我们最近关于脂质scramblase TMEM16的研究中，我们能够在激活条件下获得几种超燃酶结构。我们将这些不同的构象解释为该蛋白逐步激活机制的快照，并提出其中一种中间状态可能与某些TMEM16蛋白中观察到的非选择性离子传导有关。

媒体:在您的研究领域里使用cryo-EM有什么限制吗?如何才能克服这些限制?

CP: cryo-EM在过去几年里发展得如此之快和如此之多，我感到非常兴奋。尽管该技术不断地重新定义其局限性并变得更加用户友好，但我们仍然面临一些挑战。然而，对于x射线晶体学来说，获得完全可操作和维护的同步加速器束流线基本上是免费的，而cryo-EM的总体成本和操作所需的专业水平一直是一个障碍。在一定程度上，政府对cryo-EM设备的补贴缓解了这一问题，但并没有完全解决。

在我的小组中，我们有一个内部的高端cryo-EM供我们使用，我们确保对所有小组成员进行彻底的培训。其他障碍包括图像处理集群的获取和成本、数据管理(每天可以记录几个TB数据)和图像处理方面的专门知识。幸运的是，它的成本随着时间的推移而降低，而图形处理单元驱动软件的实现使成本保持在可承受范围内。当然，样品制备有很大的改进空间(例如，需要更少量的蛋白质并避免空气 - 水界面)，几个团队和公司正在致力于解决这个问题。

最后，解决一个结构所需的总时间，以及尺寸和平均分辨率的限制，仍然对基于结构的药物设计所需的高通量方法构成挑战和阻碍。这些问题正在通过结合更稳定的电子显微镜、更好和更有效的电子探测摄像机和改进的处理算法得到解决。