主要食用菌中转基因成分定性PCR检测方法（实验）

一、实验原理：

样品经过提取 ＤＮＡ 后，针对转基因食用菌所导入的常见外源基因的基因序列设计引物，通过 ＰＣＲ技术，对外源基因的 ＤＮＡ 片段进行特异性扩增，根据实验结果，判定该食用菌样品是否含有外源基因成分。

二、仪器配置：

1、电子天平：感量为0.001ｇ与0.0001ｇ。

2、粉碎机。

3、鼓风干燥箱。
4、微量移液器：体积范围是0.20μL～2.0μL， 2μL～20μＬ， 20μＬ～200μＬ， 200μＬ～1000μＬ，枪头用前应高压灭菌处理。
5、旋涡振荡器。

6、恒温水浴锅：恒温范围为室温～100℃ ，精度为±0.5℃ 。

7、台式高速离心机，低温冷冻高速离心机，小型瞬时离心机。

8、 DNA 浓缩仪。
9、核酸蛋白分析仪。

10、PCR 仪。

11、电泳仪。

12、电泳槽。

13、凝胶分析成像系统。

14、PCR超净工作台或生物安全柜。

15、微波炉。
16、高压灭菌锅。
17、PH 计。
18、制冰机。
19、纯水机。

20、低温冰箱(-20℃以下）。

21、真菌NDA提取试剂盒。

三、测定方法：

1、DNA提取

      称取100 mg烘干后研磨成粉的样品，于1.5 mL的离心管中，加 600 μL 2％CTAB缓冲液，5 μL蛋白酶K（ 20 mg/mL） ，5 μL Rnase A（10 μg/mL ） ，剧烈振荡30 s以上， 65℃温浴1h，期间定期振荡。 加600 μL水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25:24:1） ，剧烈振荡， 12000 g离心15 min。 取上清液，再加等体积的水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25:24:1） ，振荡混匀，12000 g 离心 15 min。 取上清液，加0.8倍体积异丙醇，混匀，12000 g 离心10 min。 取沉淀，加入400 μL氯化钠（1 mol / L）于65℃温浴中溶解，加等体积的水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25:24:1） ，振荡， 12000 g离心15 min。 取上清液，加2倍体积的无水乙醇，轻微振荡， 12000 g离心10 min。取沉淀， 70％乙醇清洗2次，干燥，加100 μL TE（pH8.0）溶解。每个样品设2个重复。

2、DNA 浓度与纯度测定

      DNA 用核酸蛋白分析仪测定260nm和280nm 处吸收值，分别计算DNA纯度与浓度，DNA 纯度等于 OD260/OD 280 ，比值在1.7~2.0之间较为理想。 双链 DNA 浓度（μg/mL）等于50倍 OD260值。

3、定性PCR检测

（1）PCR反应体系

         食用菌中的内源 18 Sr DNA 基因与外源基因采用的PCR 检测体系见表1。 每个样品反应体系设2个重复（同时做2管）。

表1 定性PCR检测参考反应体系

（2）PCR 反应体系对照的设置

         PCR检测时设立置阳性对照、阴性对照和空白对照。

         阳性对照：转基因食用菌的阳性质粒或转基因食用菌中提取的 DNA。
         阴性对照：非转基因食用菌中提取的DNA。
         空白对照：用配制反应体系的实验用水代替模板。

（3）PCR反应热循环参数的设置

         94℃预变性2min。 94℃变性30ｓ ，54℃退火40ｓ ，72℃ 延伸1 min ，40个循环。 72℃ 延伸 5min 。 4℃下保存。 也可根据不同的基因扩增仪对PCR反应热循环参数做相应的调整。

（4）PCR扩增产物的电泳检测

        用0.5×TBE 电泳缓冲液制备2 ％ 的琼脂糖凝胶。 将 8 μL～10 μL 的 PCR扩增产物 分别与1 μL～2 μL的6×加样缓冲液（电泳前沿指示剂）混合后，在凝胶板上的孔中点样。 用分子量大小适当的 DNA Marker 做分子量标记。 选择合适的电压（ 3V/cm ～5 V / cm），电泳时间为 5o min～60min。用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析。

5、结果判断

（1） 样品DNA抽提质量判断

          按照真核生物共有的核糖体18 Sr DNA基因的序列设计的引物，对食用菌阴性样品与待测样品的DNA 提取液进行PCR 扩增。 均应扩增出137 bp的片段，否则，说明提取的 DNA 质量有问题，或者是DNA 溶液中存在 PCR 反应的抑制因子，应该重新纯化或提取DNA，直至扩增出该DNA片段，防止检测中产生假阴性结果。

（2） 外源基因的检测
          阴性对照与空白对照未扩增出DNA 片段，阳性对照扩出预期的 DNA 片段，待测样品未扩增出预期的 DNA 片段，可以断定待测样品中不含有外源基因，如果扩出预期的 DNA 片段，则可初步判定待测样品中含有可疑的外源基因，应进一步进行确证实验。

（3）结果确证实验与结果表述

         1）采用实时荧光PCR检测方法或者委托有资质的生物技术公司进行委托确证。
         2）结果表述：确证为阳性的，表述为：检出 × × × × 基因；确证为阴性的，表述为：未检出××××基因。

 5、样品保存

（1） 保存条件
          燥样品保存在常温下，新鲜样品保存于－20℃下。

（2）保存期限：3个月。

联系人：孙庆磊 17615852702