总黄曲霉毒素检测试剂盒

总黄曲霉毒素（AFs）酶联免疫测试盒



本测试盒用间接竞争免疫分析法定量测定谷物中总黄曲霉毒素。该测试盒反应孔可拆卸，可测单份样品，也可测多份样品。定量分析时需有含450nm波长的微孔板酶标仪。



1 概要

黄曲霉毒素是由曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物。主要污染玉米、花生、坚果等。天然污染的黄曲霉毒素以AFB1、AFB2、AFG1、AFG2为主，总黄曲霉毒素一般指这四种毒素的总量。黄曲霉毒素属于最强烈的天然致癌物质，肝脏是其主要的靶器官，其中AFB1毒性最强，具有极强的急性毒性和致癌性。其检测方法主要有薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法（HPLC），本试剂盒可以准确快速检测粮谷类和花生及饲料中的总黄曲霉毒素。



2 测定原理

本测试盒用固相酶联免疫吸附原理，利用间接竞争ELISA法进行测定。用抗原包被微孔板，加入黄曲霉毒素B1标准品或样品、总黄曲霉毒素单克隆抗体进行免疫反应后，将未与包被抗原结合的抗体洗去；再加入酶标记的抗鼠IgG抗体孵育，加入底物显色，终止液终止后，用酶标仪在450nm处测定OD值。



3 提供的试剂及材料

微孔板………………………………………………………………………… 包被有AFB1-BSA

5个浓度的AFB1标准溶液各（1mL）……………………………………………直接使用

标准1：0ng/mL …………………………………………………………….直接使用

标准2：1.0ng/mL …………………………………………………………….直接使用

标准3：2.0ng/mL …………………………………………………………….直接使用

标准4：5.0ng/mL …………………………………………………………….直接使用

标准5：10.0ng/mL ……………………………………………………….直接使用

AFS单克隆抗体溶液（6mL）……………………………………………………..直接使用

酶标物(12mL). ……………………………………………………………………..直接使用

显色液(12mL)….. .….. .….. .….. .….. .….. ………………………………….........直接使用

终止液(6mL)……. .….. .….. ………………………………………………………直接使用

浓缩洗液(30mL) ...….……….….. .….. .….. ………………………………………稀释使用

空白对照（6ml）……………………………………………………………………直接使用



4 盒中未提供，需自备物品

4.1 设备

微孔板酶标仪（含450nm）：定量分析用

振荡器，粉碎机，微量移液器，量筒，漏斗和容量瓶，快速定性滤纸

4.2 试剂

氯化钠（分析纯）

甲醇（分析纯）

去离子水或蒸馏水



5 操作者注意事项

----标准溶液中含有黄曲霉毒素，应特别小心。

----使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液最好用pH7的次氯酸溶液（10%v/v）浸泡过夜。

----终止液为0.5N硫酸，避免接触皮肤。

----不要使用过了有效日期的试剂盒。

----不要交换使用不同批号盒中的试剂。



6 储存条件

----保存试剂盒于2-8℃。不要冷冻

----显色液对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

----将不用的微孔板放进原锡箔袋中，置2-8℃保存。



7 试剂变质的标志

----0ng/mL标准的吸光度值小于0.5个单位 (A450nm<0.5)时，表示试剂可能变质。



8 样品处理

样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存

----取5g粉碎的有代表性的样品，加1.25g氯化钠及25mL70% 甲醇-水

----强力振荡3分钟

----用快速定性滤纸过滤

----取1mL滤液，用1%氯化钠溶液稀释10倍

----取50μL稀释液进行分析

*根据需要可以增加样品量，但甲醇溶液的量也应相应增加。



9 酶标免疫分析程序

9.1注意事项

1. 每次加样后立即将所有试剂放回2-8 ℃

3. 每步操作时间控制在5min内。

4. 孵育过程中应避光。



9.2 试剂稀释

1. 浓缩洗液：使用时用去离子水或蒸馏水与本浓缩液按体积比9:1稀释。



9.3 测定程序

1. 取所需数量的板条插入微孔架，记录样品及标准的位置。

2. 加入50mL标准品或处理好的样品到微孔，每个标准和样品必须使用新的吸头。

3. 将50mL抗总黄曲霉毒素单克隆抗体使用液加入到每个微孔（注意移液器管尖不要接触到放进孔中的液体，避免交叉污染），在适当位置孔加空白对照液100mL，37℃孵育90min。

4. 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。

5. 每孔加入酶标物100mL，37℃孵育60min。

6. 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。

7. 每孔加入显色液100mL（2滴），37℃孵育10 min -12min。

8. 每孔加入终止液50mL（1滴），立即用酶标仪在波长为450nm处测定吸光度值（OD值）。



10 样品浓度计算

以标准溶液OD值与第一个标准（0ng/mL）OD值的比值为纵坐标，所对应标准溶液浓度（ng/mL）的对数值为横坐标，制作标准曲线。根据样品OD值与0ng/mL标准OD的比值，从曲线上得到对应点的横坐标，即为AFs浓度的对数值，求得反对数即为测定液中AFs浓度C（ng/mL），按下列公式计算出样品中AFs含量：

AFs含量（mg/kg）= C×K

式中：C：测定液中AFs浓度（ng/mL）

K: 测定液对样品的稀释倍数（本提取方法为50）



11试剂盒主要技术指标及参数

测试盒最低检出浓度1.0ng/mL，回收率70%-120%，交叉反应系数小于1%，试剂盒校正曲线的线性范围1.0ng/mL -10.0ng/mL，试剂盒条内变异＜10%，条间变异＜15%。