干血片中17-OHP、A4、S、21-DOC、F检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-539Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-555 Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications Centerhttp：//www.shimadzu.com.cnEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996 串联质谱法用于先天性肾上腺皮质增生症筛查诊断应用研究 LCMSMS-555 摘要：使用串联质谱及21-羟化酶缺乏症五种相关激素测定试剂盒，建立了滤纸干血片中17-羟孕酮(17-OHP)、雄烯二酮(A4)、11-脱氧皮质醇(S)、21-脱氧皮质醇(21-DOC)、皮质醇(F)含量测定方法。使用试剂盒的内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，假阳性率低，可用于先天性肾上腺皮质增生症辅助筛查诊断。 关键词：串联质谱先天性肾上腺皮质增生症滤纸干血片筛查诊断 先天性肾上腺皮质增生症 (Congenital adrenalhyperplasia， CAH) 是一组由肾上腺皮质类固醇合成过程中各类催化酶的缺陷，引起以皮质类固醇合成障碍为主要特征的常染色体隐性遗传性疾病。 CAH 按照酶缺陷类型的不同大致可分为六型，其中以21-羟化酶缺乏症 (21-Hydroxylase deficiency， 21-0HD) 最常见，约占90%~95%；其次为113-羟化酶缺乏症，约占3%~5%。21-OHD 在新生儿中的发病率约为1/20000~1/10000。在新生儿出生后开展 CAH 的早期筛查、尽早诊断、及时治疗，对降低新生儿死亡率、减少女婴外生殖器男性化而造成性别误判、改善生长发育具有重要意义。目前，我国已将 CAH 作为优先推荐筛查病种，常规筛查通过免疫法检测血中17-羟孕 酮(17-OHP)水平实现 CAH筛查，但该方法假阳性率较高，召回率较高。《先天性肾上腺皮质增生新生儿筛查共识》推荐使用 LC-MS/MS 法同时测定干血片中17-羟孕酮(17-OHP)、雄烯二酮(A4)、11-脱氧皮质醇(S)、21-脱氧皮质醇(21-DOC)、皮质醇(F)， 该方法具有较高的特异性及敏感性，假阳性率低。 本文使用超高效液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8045及21-羟化酶缺乏症五种相关激素测定试剂盒(液相色谱-串联质谱法，北京华大吉比爱生物科技有限公司)，建立了滤纸干血片中17-OHP、A4、S、21-DOC、F含量测定方法，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，假阳性率低，，可用于CAH 辅助筛查诊断。 实验部分 1.1仪器 ( 本实验使用超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用系统。 具 体配置为： ) 输液泵： LC-40D XR×2在线脱气机：DGU-405自动进样器：SIL-40C XR柱温箱：CTO-40C 系统控制器：CBM-40 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack Velox C18 50 mm×2.1mmI.D.， 1.8 um； P/N： 227-32007-02；岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A：0.1%甲酸水(含2mM乙酸铵)B：0.1%甲酸甲醇(含2mM乙酸铵) 进样羊：10pL 柱温：45℃ 流速：0.4mL/min 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为45%，洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps B.Conc 45 3.00 Pumps B.Conc 95 3.50 Pumps B.Conc 95 3.60 Pumps B.Conc 45 5.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8045 CL 离子源： ESI(+)雾化气流速：3.0 L/min 干燥气流速：8.0 L/min DL温度：150℃加热模块温度：450℃离子源温度：300℃扫描模式：多反应监测(MRM) 加热器流速：12.0L/min MRM参数：见表2 表2 MRM 参数 名称 英文名 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 17-羟孕酮 17-OHP 331.2 109.1 -16 -32 -20 331.2 97.1 -10 -29 -16 17-羟孕酮内标 17-OHP-IS 334.2 112.1 -16 -32 -20 雄烯二酮 A4 287.2 97.1 -13 -30 -22 287.2 109.1 -15 -25 -16 雄烯二酮内标 A4-IS 290.2 100.1 -13 -30 -22 11-脱氧皮质醇 S 347.2 109.1 -15 -28 -20 347.2 97.1 -14 -25 -18 11-脱氧皮质醇内标 S-IS 352.2 113.1 -15 -28 -20 21-脱氧皮质醇 21-DOC 347.2 311.2 -16 -16 -20 347.2 269.2 -16 -15 -29 21-脱氧皮质醇内标 21-DOC-IS 355.3 319.2 -16 -16 -20 皮质醇 F 363.2 121.2 -15 -25 -21 363.2 327.2 -20 -15 -25 皮质醇内标 F-IS 367.2 121.2 -15 -25 -21 1.3材料与方法 1.3.1材料 8个浓度标准品干血片：试剂盒提供 高低质控干血片：试剂盒提供 内标准品：试剂盒提供 1.3.2方法 内标准品溶液制备：向内标准品瓶中加入500 uL甲醇， 涡旋30s， 得到内标储备液；使用时，将内标储备液与甲醇按照1：99 稀释，混匀，得到内标工作液。 标准品及样本前处理方法：用打孔器将标准品，质控品及样品干血片打出血点，放入96孔板中，每孔打入2个血点；之后向每孔中加入200pL内标工作液，将96孔板封膜，在25℃， 500 rpm下，混匀30min；静置后，每孔取150 uL上清液于另一96孔板中，氮气吹干；每孔中加入75 uL45%甲醇复溶，覆膜后涡旋混匀3min，上机测定。 结果讨论 2.1 MRM 色谱图 21-DOC F 图11标准曲线最低点谱图 2.2线性测定结果 对标准品按1.2中的分析条件进行分析，内标法制作标准曲线。标准曲线结果见表3，5种激素在标准曲线浓度范围内线性相关系数均大于0.994，准确度在86.8%~113.8%之间，满足测定需求。 表3 标准曲线结果 编号 名称 线性方程 线性范围(ng/mL) 相关系数 准确度(%) 1 17-OHP Y=(0.0214767)X+(0.0127906) 1.5~400 0.9945 86.8~111.4 A4 Y=(0.0276090)X+(0.00192108) 1.5~400 0.9970 90.5~110.7 3 S Y=(0.0281403)X+(0.00568528) 1.5~400 0.9967 93.0~113.8 4 21-DOC Y=(0.0355860)X+(0.0208844) 1.5~400 0.9971 92.3~113.5 5 F Y=(0.0268318)X+(0.0262039) 1.5~400 0.9968 89.8~109.0 2.3准确度测定结果 按1.3中的前处理方法对低高浓度质控品前处理，按1.2中的分析条件对质控品进行分析，质控品的准确度结果如表4所示，结果显示质控品测定准确度结果与理论值接近，均在赋值范围内，满足临床测定需求。 表4 质控准确度考察结果(ng/mL) 质控 LQC HQC 理论浓度 测定浓度 赋值范围 理论浓度 测定浓度 赋值范围 17-OHP 20.4 21.3 17.1~23.7 299.7 283.2 256.2~343.2 A4 3.7 3.9 2.9~4.4 296.4 270.1 250.9~341.9 S 19.2 18.5 15.9~22.4 312.6 198.3 255.6~369.7 21-DOC 5.0 5.2 4.1~5.9 303.2 292.4 252.0~354.4 F 17.9 17.7 13.4~22.5 311.0 301.9 259.8~362.1 2.4精密度测定结果 取低浓度质控品溶液，连续进样6针，考察仪器精密度，具体峰面积精密度见表5，结果显示，5种激素在测定浓度下峰面积精密度在1.2%~4.8%之间， LCMS-8045测定5种激素精密度良好。 表5精密度测定结果 (ng/mL) Name 平均峰面积 RSD% 17-OHP 196883 2.1 A4 80656 1.2 S 275174 2.6 21-DOC 33705 4.8 108649 1.9 结论 使用超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用系统及21-羟化酶缺乏症五种相关激素测定试剂盒(液相色谱-串联质谱法，北京华大吉比爱生物科技有限公司)，建立了滤纸干血片中 17-羟孕酮(17-OHP)、雄烯二酮(A4)、11-脱氧皮质醇(S)、21-脱氧皮质醇(21-DOC)、皮质醇(F)含量测定方法。使用试剂盒的内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.994，准确度及精密度均满足试剂盒要求。该方法对先天性肾上腺皮质增生症的筛查诊断 岛津应用云 具有重要参考意义。 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心 使用超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用系统及21-羟化酶缺乏症五种相关激素测定试剂盒（液相色谱-串联质谱法，北京华大吉比爱生物科技有限公司），建立了滤纸干血片中17-羟孕酮(17-OHP)、雄烯二酮(A4)、11-脱氧皮质醇(S)、21-脱氧皮质醇(21-DOC)、皮质醇(F)含量测定方法。使用试剂盒的内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.994，准确度及精密度均满足试剂盒要求。该方法对先天性肾上腺皮质增生症的筛查诊断具有重要参考意义。