猪肉，动物源性食品中妥曲珠利砜残留检测方案(固相萃取)

「应用纪要]WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要] Oasis PRiME HLB-UPLC-MS/MS测定动物源性食品中168种兽药残留 孙超、黄德凤 经优化的提取溶剂可以将多种兽药高效率的提取出来 Oasis PRiME HLB可以将动物源性样品基质中的磷脂等干扰杂质成功的去除，有利于提高检测的准确性 Quanpedia数据库方便LC-MS/MS方法开发 简便快速的操作流程 稳定的回收率和精密度 关键词 ( Oasis PRiME HLB， Xevo TQ-XS， ) ( Quanpedia，肌肉，多兽药残留 ) 摘要 本实验是使用OasisPRiME HLB处理动物生性样品基质，建立了动物肌肉样品中168种兽药残留同时检测的方法。样品经酸化乙腈溶液提取，利用Oasis°PRiME HLB固相萃取小柱通过式净化处理除去磷脂， UPLC-MS/MS检测。在经过前处理方法与仪器条件优化后，添加浓度为0.5~10 pg/kg的范围内时，磺胺、喹诺酮、氯霉素、β-受体激动剂、四环素、糖皮质激素、大环内酯、硝基咪唑、苯并咪唑、内酰胺、金刚烷胺、头孢、性激素、镇静剂、阿维菌素、孔雀石绿、喹乙醇、玉米赤霉醇、抗菌剂、抗球虫剂、杀虫剂、非甾体类抗炎药、氨苯砜等23类，共168种药物回收率在20%-120%，精密度RSD<20%(n=5)。 前言 众所周知，兽药被广泛的应用于治疗或预防动物物病。动物在使用兽药后，在细胞、组织或器官内蓄积或储存药物原型、有毒性的代谢物或杂质，形成兽药药留(Veterinary drug residue)。 我国在畜牧养殖方面使用较多的兽药主要有磺胺类、喹诺酮类、β-受体激动剂类、糖皮质激素类、氯霉素类、头孢类等化合物。滥用兽药易造成畜牧产品及环境的严重污染，并通过代谢途径进入畜禽产品中，最终被人体摄入并蓄积，导致过敏反应且使人体产生抗药性等副作用。因此，监测多种兽药在猪肉为代表的肉制品中的残留对保证证制品的安全具有积极意义。目前，相关标准和文献报道的多兽药残留的同时检测方法大多按照兽药种类分成若干种检测方法，对于日益增长的检测量而言需要耗费大量的人力物力，因此亟需一个统一简便的多残留检测方案。 此创新的填料能够有效的将样品基质中的蛋白、磷脂等干扰杂质去除干净。采用Waters UPLC/Xevo°TQ-XS系统，结合QuanpediaTM数据库，建立稳定高效的多兽药残留液相色谱串联四极杆分析方法，获得准确分析结果。 试验部分 仪器，试剂与材料 Waters ACQUITY UPLCI-Class FTN， Waters Xevo TQ-XS三重 流速： 0.45 mL/min 四极杆质谱，纯水机， Milli-Q，台式高速离心机，旋涡振荡仪，移液 柱温： 45°C 枪，乙腈， Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200mg， 6 CC) 样品温度： 10°C 进样量： 2uL 样品前处理 称取2.5g均质好的肉样，加入80%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)10 质谱条件mL，旋涡振荡， 4000 r/min高速离心5min，取上清液待净化。离子源： ESI+/ESI-取Oasis PRiME HLB固相萃取柱，无需活化与平衡，将3mL上清液采集方式： MRM过固相萃取柱，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液，然后再准确量取2mL流出液，氮气下吹干，1mL初始流动相定容，过GHP滤毛细管电压： 3.5 kV膜，待上机测试。 离子源温度： 150°C脱溶剂气温度： 600°C仪器条件 脱溶剂气流速度：1000L/h 液相条件 锥孔气： 150L/h 色谱柱： Waters HSS T3色谱柱 (2.1x100mm，1.8 pm) 碰撞其流速： 0.15 mL/min 流动相： 正离子：A：0.1%甲酸水溶液 B：0.1%甲酸甲醇 负离子：A：水 B：乙青 时间 (min) 流速 (mL/min) %A %B Curve 起始 0.45 98 2 起始 0.25 0.45 98 2 6 12 0.45 2 98 6 13 0.45 2 98 6 13.01 0.45 98 2 6 17 0.45 98 2 6 结果与讨论 样品处理的优化 仪器方法的优化 应用中使用甲酸酸化的乙腈溶液提取目标化合物，同时沉淀蛋白。由于过高的甲酸添加量会对磺胺类等化合物回收率有影响，故本试验中选取添加0.2%的甲酸于提取液中，且经比较，0.2%甲酸乙腈溶液能提高喹诺酮类等30多种化合物的回收率。 本实验室UPLC-MS/MS方法的建立过程使用Waters Quanpedia数据库，库中包含了1000多种化合物的LC-MS/MS方法，涵盖了几乎所有食品检测要求的兽药种类。Waters Quanpedia数据库操作简便，是包含了从液相条件、采集方法到定量处理方法的完整方法包，能大大节约方法开发时间，避免实验室间方法开发的差异。 大量存在于动物源性样品中的磷脂，干扰部分化合物分析定量，影响色谱柱寿命及仪器维护成本。利用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱净化样品，能有效去除磷脂等干扰杂质。同时，采用通过式净化策略能极大提高样品分析通量，并且经过特殊设计的Oasis PRiMEHLB流速更快且不容易被堵，也极大的提高了效率。 方法回收率和精密度 采用在空白样品中添加标准溶液的方法进行添加回收率测定。分别添加0.5ug/kg、1.0 ug/kg、2.0 pg/kg、10 ug/kg 4个浓度水平，按所建立的方法进行样品处理及测定，每个浓度水平进行3次重复测定。方法采用空白基质标准曲线，外标法定量。各添加水平的回收率分布如右图。 加标平均回收率和精密度见下表。 加标0.5 ug/kg 加标1.0 pg/kg 加标2.0 ug/kg 加标10 ug/kg 类别 项目 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 磺胺苯酰 82% 9% 71% 2% 70% 3% 62% 6% 磺胺醋酰 91% 4% 73% 2% 72% 3% 63% 6% 磺胺氯哒嗪 78% 12% 68% 11% 71% 5% 68% 5% 磺胺嘧啶 82% 3% 70% 6% 79% 1% 67% 5% 磺胺间二甲氧嘧啶 83% 11% 78% 2% 80% 8% 70% 3% 磺胺邻二甲氧嘧啶 81% 9% 78% 1% 77% 3% 70% 3% 磺胺脒SG 105% 9% 76% 12% 72% 6% 71% 7% 磺胺甲基嘧啶 84% 10% 74% 3% 76% 8% 67% 3% 磺胺对甲氧嘧啶 75% 12% 73% 7% 76% 3% 69% 3% 磺胺二甲嘧啶 94% 6% 77% 5% 73% 0% 68% 0% 磺胺类 磺胺甲噻二唑 79% 9% 70% 6% 72% 3% 71% 5% 磺胺甲噁唑 84% 5% 80% 5% 74% 6% 71% 4% 磺胺甲氧哒嗪 75% 12% 73% 7% 76% 3% 69% 3% 磺胺间甲氧嘧啶 69% 13% 69% 3% 73% 2% 68% 3% 磺胺硝苯 52% 4% 61% 4% 66% 4% 59% 4% 磺胺苯吡唑 93% 5% 75% 3% 72% 3% 64% 5% 磺胺吡啶 82% 6% 77% 6% 75% 6% 64% 5% 磺胺喹噁啉 81% 9% 70% 5% 70% 6% 61% 0% 磺胺噻唑 68% 14% 101% 1% 102% 1% 73% 2% 磺胺索嘧啶 85% 8% 73% 1% 75% 2% 67% 3% 磺胺二甲异噁唑 91% 9% 77% 2% 74% 1% 66% 5% 甲氧苄啶 91% 7% 90% 5% 83% 2% 82% 5% 接上表。 加标0.5 ug/kg 加标1.0 pg/kg 加标2.0 ug/kg 加标10 pg/kg 类别 项目 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 西诺沙星 100% 0% 89% 3% 87% 1% 83% 1% 环丙沙星 107% 14% 98% 4% 107% 3% 101% 3% 丹诺沙星 101% 2% 90% 6% 82% 4% 80% 1% 双氟沙星 99% 4% 85% 3% 82% 5% 77% 1% 依诺沙星 N/A N/A 108% 2% 107% 3% 95% 3% 恩诺沙星 94% 1% 87% 7% 79% 10% 72% 5% 氟罗沙星 99% 9% 88% 5% 84% 4% 76% 3% 喹诺酮类 氟甲喹 94% 4% 83% 1% 79% 5% 73% 3% 马波沙星 97% 5% 85% 4% 75% 4% 75% 11% 萘啶酸 95% 4% 91% 1% 87% 3% 77% 1% 诺氟沙星 103% 5% 91% 9% 88% 2% 75% 2% 氧氟沙星 95% 1% 85% 2% 82% 11% 79% 2% 奥比沙星 93% 5% 85% 2% 81% 4% 78% 4% 恶喹酸 96% 5% 92% 5% 79% 5% 77% 4% 培氟沙星 99% 2% 90% 10% 84% 11% 77% 3% 沙拉沙星 114% 5% 97% 6% 83% 5% 79% 4% 西马特罗 95% 4% 89% 3% 83% 2% 78% 2% 克伦特罗 77% 3% 75% 1% 74% 3% 74% 3% 氯丙那林 91% 4% 89% 5% 85% 2% 78% 4% β-受体 喷布特罗 87% 5% 83% 2% 78% 4% 73% 2% 激动剂类 莱克多巴胺 94% 3% 90% 4% 86% 4% 79% 6% 沙丁胺醇 93% 8% 87% 3% 83% 2% 84% 2% 特布他林 92% 3% 89% 5% 82% 4% 81% 3% 妥布特罗 94% 3% 87% 4% 82% 2% 77% 1% 氯霉素 77% 6% 89% 3% 83% 2% 78% 2% 氯霉素类 氟苯尼考 69% 2% 82% 5% 92% 2% 82% 接上表。 加标0.5 ug/kg 加标1.0 pg/kg 加标2.0 ug/kg 加标10 pg/kg 类别 项目 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 红霉素 93% 4% 86% 6% 78% 2% 71% 5% 交沙霉素 68% 8% 59% 7% 68% 7% 63% 16% 吉它霉素 76% 9% 37% 3% 48% 8% 46% 3% 林可霉素 90% 6% 88% 2% 81% 7% 81% 4% 大环内酯类 竹桃霉素 105% 0% 93% 3% 93% 2% 87% 2% 罗红霉素 88% 6% 83% 1% 74% 2% 72% 2% 螺旋霉素 105% 3% 63% 2% 65% 5% 56% 3% 替米考星 58% 11% 79% 14% 82% 12% 87% 7% 泰乐菌素 50% 7% 36% 6% 46% 5% 47% 1% 羟基异丙硝唑 100% 0% 100% 0% 97% 3% 86% 1% 羟甲基甲硝咪唑 99% 8% 76% 3% 72% 4% 69% 3% 2-甲硝咪唑 98% 3% 80% 3% 79% 1% 76% 3% 氯甲硝咪唑 93% 1% 80% 3% 74% 5% 72% 3% 硝基咪唑类 苯硝咪唑 79% 6% 73% 2% 70% 3% 73% 7% 地美硝唑 79% 5% 75% 4% 71% 5% 59% 4% 异丙硝哒唑 64% 5% 59% 4% 62% 4% 52% 8% 甲硝唑 96% 5% 83% 4% 81% 1% 74% 4% 甲硝唑代谢物 92% 1% 81% 5% 79% 5% 75% 3% 洛硝哒唑 103% 3% 90% 1% 84% 3% 74% 8% 2-氨基氟苯咪唑 81% 4% 76% 2% 73% 1% 68% 4% 5-羟基甲苯咪唑 81% 10% 75% 1% 71% 4% 68% 1% 5-羟基噻苯咪唑 84% 9% 80% 4% 75% 2% 70% 2% 阿苯达唑 42% 5% 65% 5% 62% 1% 60% 2% 阿苯达唑砜 92% 5% 91% 2% 87% 4% 83% 3% 阿苯达唑亚砜 104% 3% 93% 6% 87% 2% 81% 4% 阿苯达唑-2-氨基砜 99% 6% 86% 3% 80% 3% 75% 5% 噻苯咪唑酯 87% 接上表. 加标0.5 ug/kg 加1.0 pg/kg 加标2.0 ug/kg 加标10 pg/kg 类别 项目 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 阿莫西林 61% 5% 68% 6% 53% 4% 48% 8% 氨苄西林 68% 4% 61% 7% 58% 2% 56% 7% 氯唑西林 84% 10% 88% 6% 81% 4% 75% 3% 内酰胺类 双氯西林 75% 9% 72% 7% 68% 3% 64% 9% 奈夫西林 79% 5% 77% 4% 73% 2% 70% 3% 苯唑西林 80% 9% 88% 8% 85% 5% 72% 5% 青霉素V 87% 7% 89% 6% 81% 8% 78% 4% 青霉素G 53% 7% 44% 5% 36% 2% 40% 9% 金刚烷胺 85% 14% 93% 6% 84% 4% 83% 4% 金刚烷胺类 美金刚 102% 2% 84% 4% 86% 3% 81% 2% 金刚乙胺 101% 1% 84% 4% 90% 2% 78% 1% 头孢匹啉 93% 4% 90% 6% 89% 2% 80% 8% 头孢唑啉 91% 6% 90% 2% 88% 5% 83% 6% 头孢哌酮钠 92% 4% 89% 7% 86% 7% 81% 6% 头孢喹肟 89% 9% 86% 5% 82% 3% 79% 9% 头孢类 头孢噻呋 100% 2% 95% 4% 92% 3% 78% 3% 头孢氨苄 99% 2% 95% 5% 92% 3% 77% 7% 头孢洛宁 87% 7% 85% 8% 83% 7% 76% 8% 头孢乙腈 95% 4% 90% 4% 90% 5% 83% 7% 头孢噻肟 90% 2% 88% 2% 82% 3% 79% 8% 头孢拉定 84% 5% 81% 2% 78% 5% 75% 7% 19-炔诺酮 84% 4% 78% 3% 68% 8% 62% 3% 19-去甲睾酮 N/A N/A 91% 2% 80% 11% 64% 4% 醋酸氯地孕酮 54% 10% 57% 10% 54% 8% 50% 2% 醋酸甲孕酮 72% 12% 68% 8% 59% 6% 55% 2% 性激素类 甲基睾酮 87% 10% 76% 5% 67% 5% 59% 3% 接上表。 加标0.5 ug/kg 加标1.0 ug/kg 加标2.0 ug/kg 加标10 pg/kg 类别 项目 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 回收率(%) RSD(%) n=5 结晶紫 53% 5% 40% 4% 37% 3% 33% 8% 隐色结晶紫 N/A N/A 23% 7% 23% 12% 23% 4% 孔雀石绿类 隐色孔雀石绿 N/A N/A 25% 7% 24% 2% 26% 7% 孔雀石绿 67% 11% 49% 4% 49% 9% 39% 12% 喹乙醇代谢物 喹乙醇代谢物(MQCA) N/A N/A 29% 7% 39% 3% 48% 1% 玉米赤霉酮 44% 3% 48% 10% 48% 12% 53% 9% 玉米赤霉 玉米赤霉烯酮 N/A N/A 45% 8% 42% 9% 41% 9% 醇类 α-玉米赤霉烯醇 N/A N/A 38% 11% 58% 7% 51% 5% β-玉米赤霉烯醇 N/A N/A 33% 6% 48% 2% 49% 4% 抗菌剂类 二甲氧苄啶 101% 1% 91% 2% 92% 2% 80% 3% 维吉尼霉素M1 98% 3% 90% 2% 88% 2% 79% 3% 氯羟吡啶 99% 2% 70% 3% 83% 2% 77% 0% 癸氧喹酯 53% 6% 30% 12% 31% 9% 30% 5% 地克珠利 N/A N/A 33% 11% 44% 10% 41% 8% 乙氧酰胺苯甲酯 62% 3% 79% 2% 85% 3% 87% 2% 抗球虫剂类 常山酮 114% 0% 84% 4% 85% 3% 87% 2% 甲苄喹啉 77% 4% 63% 5% 63% 2% 58% 1% 氯苯胍 59% 2% 36% 6% 36% 7% 32% 3% 妥曲珠利砜 N/A N/A 37% 7% 40% 5% 31% 9% 妥曲珠利亚砜 N/A N/A 28% 2% 39% 17% 45% 6% 克百威 78% 6% 77% 2% 72% 1% 67% 5% 蝇毒磷 57% 19% 48% 2% 44% 3% 35% 5% 杀虫剂类 倍硫磷砜 90% 2% 57% 4% 75% 4% 71% 1% 倍硫磷亚砜 103% 5% 90% 2% 90% 1% 82% 3% 马拉硫磷 77% 5% 61% 12% 47% 10% 55% 6% 辛硫磷 96% 4% 95% 8% ( 结论 ) ( 实验成功建立了同时测定23大类共168种兽药残留的分析方法。分析结果满足动物源性食品中兽药残留检测的相关要求。 ) Oasis PRiME HLB固相萃取柱简单的通过式净化处理能有效去除样品中磷脂等干扰物，且处理过程简单高效，适用于大批量日常分析检测。 ( Waters Quanpedia数据库包含多兽药残留分析所需的LC-MS/MS方法，能节约方法开发成本，避免实验 室间方法差异。 ) 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-6156 2666 广州：020-28296555 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400) 820 2676WWW.Waters.com Oasis PRiME HLB-UPLC-MS/MS测定动物源性食品中兽药残留 本实验是使用Oasis PRiME HLB处理动物源性样品基质，建立了动物肌肉样品中168种兽药残留同时检测的方法。样品经酸化乙腈溶液提取，利用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱通过式净化处理除去磷脂，UPLC-MS/MS检测。结论：- 实验成功建立了同时测定23大类共168种兽药残留的分析方法。分析结果满足动物源性食品中兽药残留检测的相关要求。- Oasis PRiME HLB固相萃取柱简单的通过式净化处理能有效去除样品中磷脂等干扰物，且处理过程简单高效，适用于大批量日常分析检测。- Waters Quanpedia数据库包含多兽药残留分析所需的LC-MS/MS方法，能节约方法开发成本，避免实验室间方法差异。