小鼠粪便提取物中短链脂肪酸-磷酸检测方案(液相色谱仪)

LAAN-A-LC222 ApplicationnNo.L516News第一版发行日：2017年3月400-650-0439 ApplicationNews 高效液相色谱法 有机酸分析系统对肠道菌群研究的应用 近年来，逐渐阐明了肠道内的肠道菌群对宿主的健康维护具有增进效果。肠道菌群给宿主带来的有益影响被认为与肠道菌群产生的代谢产物有关。1) 此类代谢产物中含有多种物质，因此可考虑采用 LC-MS进行分析，但LC-MS的流动相中会用到甲酸和乙酸，因此无法对上述有机酸进行检测。 相对于此， HPLC的离子排斥模式与柱后反应检测法相结合的方法(柱后缓冲电导法)不会使用甲酸和乙酸作为流动相，因此能够高灵敏度和选择性的检测出含有甲酸和乙酸的有机酸。 在此，我们对采用有机酸分析系统测定小鼠粪便提取物中肠道菌群产生的短链脂肪酸代谢产物的示例进行介绍。 Y. Oka 标准样品溶液的分析 分析条件如表1所示。进样10 uL标准溶液(各20 mmol/L)的结果如图1所示。 表1分析条件 Column ： Shim-pack SCR-102H (300 mmL. ×8.0mmI.D.)×2 Guard column ：Guard column SCR-102H (50 mmL. × 6.0 mml.D.) Mobile phase ： 5 mmol/L p-toluenesulfonic acid Flow rate of mobile phase ： 0.8 mL/min ： 5 mmol/L p-toluenesulfonic acid pH buffering solution 20 mmol/L Bis- Tris 0. 1 mmol/L EDTA Flow rate of pH buffering solution ：0.8 mL/min Column temp. ： 45℃ Detection ： Conductivity detector (CDD-10Avp) Injection vol. ： 10 pL 图1标准溶液的色谱图 校准曲线 在表1的条件下分析的丙酸的校准曲线如图2所示。在0.1~2.0 mmol/L 和 1.0~20 mmol/L 的范围内制作了校准曲线。各成分线性良好，线性相关系数R²在 0.999以上。 有机酸分析流动相试剂组 有机酸分析流动相试剂组是制备完毕的流动相和 pH缓冲剂的套装，开封后必须立即使用的。不仅能减少制备溶液花费的时间和成本(※)，还能降低制备错误的风险，使分析过程一直保持稳定。※每年能削减约7万日元的成本(本公司的估算值) 图3有机酸分析流动相试剂组 |预处理 从小鼠粪便提取代谢产物所需的预处理流程如图4所示。回收在通常环境下饲养的 C57BL/6J小鼠的粪便，向新鮮粪便50 mg中添加磷酸盐缓冲液450pL后，搅拌，离心分离上清液，经超滤后供作测量用样本。 小鼠粪便提取液的分析 进样10 uL小鼠粪便提取液的结果如图5所示。检测出了用LC-MS 难以检测的、含乙酸和甲酸在内的7种成分。 各成分的定量结果如表2所示。 表2定量结果 No. Compounds ： Quantitative value (mmol/L) 1 Phosphoric acid ： 7.88 2 Succinic acid ： 0.07 3 Lactic acid ： 0.26 4 Formic acid ： 0.13 5 Acetic acid ： 2.69 6 Propionic acid ： 0.59 8 Butyric acid ： 0.61 图4预处理的流程图 图5小鼠粪便提取液的色谱图 ( 参考文献 ) ( 1)M. M atsumoto， R. Kibe， T. Ooga， Y . Aiba， S . K u rinara， E. Sawaki， Y .Koga， Y . Benno： Scientific Reports 2 ， 223 (2 0 12). ) ( 2)星清子，大肠内容物的有机酸测量方法：消化道的营养、生理和肠内 细菌11-25(2011) ) ( 注)未对粪便进行均匀搅拌时，使用均质化用的研杵将其粉碎，之后在旋涡混合器中搅拌。 ) ※本测量中使用的样本由协同乳业株式会社的松本老师提供。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 http：//www.shimadzu.com.cn 用户服务热线电话： 800-810-0439 近年来，逐渐阐明了肠道内的肠道菌群对宿主的健康维护具有增进效果。肠道菌群给宿主带来的有益影响被认为与肠道菌群产生的代谢产物有关。1）此类代谢产物中含有多种物质，因此可考虑采用LC-MS进行分析，但LC-MS的流动相中会用到甲酸和乙酸，因此无法对上述有机酸进行检测。相对于此，HPLC的离子排斥模式与柱后反应检测法相结合的方法（柱后缓冲电导法）不会使用甲酸和乙酸作为流动相，因此能够高灵敏度和选择性的检测出含有甲酸和乙酸的有机酸。在此，我们对采用有机酸分析系统测定小鼠粪便提取物中肠道菌群产生的短链脂肪酸代谢产物的示例进行介绍。在0.1～2.0 mmol/L和1.0~20 mmol/L的范围内制作了校准曲线。各成分线性良好，线性相关系数R2 在0.999以上。