蜂蜜中雷公藤定碱检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-191 Excellence in ScienceLCMSMS-205 咨询电话：021-22013542上海市淮海西路570号红坊E楼http：//www.shimadzu.com.cn 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用检测蜂蜜中的雷公藤定碱和次碱 LCMSMS-205 摘要：本文建立了一种使用岛津高效液相色谱和三重四极杆质谱联用技术同时测定蜂蜜中雷公藤定碱和次碱的方法，可快速、准确地测定蜂蜜中的雷公藤定碱和次碱含量。本文对目标物的线性关系、重复性、检出限和定量限及加标回收率进行了验证。结果表明，目标物的标准曲线线性良好，相关系数均大于 0.999，准确度范围在87.7%~113.8%，仪器定量限为0.0043 ng/mL~0.009 ng/mL。仪器的重复性良好，不同浓度混合标准溶液连续进样6次，保留时间和峰面积相对标准规偏差分别在 0.09%和6.01%以下。空白蜂蜜基质加标经过前处理后，回收率在98.8%~116.0%之间。 关键词：蜂蜜 雷公藤 三重四极杆质谱 近些年，有毒蜂蜜致人死亡事件时有报道。雷公藤属于 GB 14963-2011 《蜂蜜》中明确规定的有毒蜜源植物之一，雷公藤定碱、次碱等生物碱具有一定的生物毒性。本文建 立了一种利用高效液相色谱和三重四极杆质谱联用技术同时检测蜂蜜中的雷公藤定碱(Wilfordine)和雷公藤次碱(Wilforine)的实验方法。 图2.雷公藤次碱(Wilforine) 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-20A与三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用系统，包括LC-20ADx2(输液泵)， SIL-20A(自动进样器，配 Rinse Pump)， CTO-20A(柱温箱)， CBM-20A(系统控制器)， DGU-20As(在线脱气机)， LCMS-8050(三重四极杆液质)和 LabSolutionsVer 5.72(工作站)。 液相色谱条件 流动相： A 相：0.1%甲酸水溶液； B相：乙腈 流 速： 0.35 mL/min 色谱柱： Inertsil C8-3 2.1 mm I.D.x 150 mm L.，5 um 柱 温： 35℃ 洗脱方式： 梯度洗脱，初始浓度为 B相30%，时间程序见表 1 表1.梯度时间程序 Time Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 30 4.00 Pumps Pump B Conc. 90 5.00 Pumps Pump B Conc. 90 5.10 Pumps Pump B Conc. 30 10.00 Controller Stop 进样量：10uL 质谱条件 分析仪器： LCMS-8050 离子源： ESI (+) 离子源接口电压： 4.5 kV 加热气： 空气8L/min 雾化气： 氮气 3.0L/min 干燥气： 氮气12L/min 碰撞气： 氩气 源温： 400℃ 脱溶剂管温度： 150℃ 加热模块温度： 300℃ 扫描模式： 多反应监测(MRM) 留时间及延迟时间： 120 ms、3ms 表2.雷公藤定碱和次碱的 MRM 参数 名称 CAS No. 前体离 产物离 Q1 Pre CE Q3 Pre 子 子 Bias (V) (V) Bias (V) 雷公藤定碱 37239-51-3 884.30 856.20° -12 -25 -30 176.10 -12 -50 -18 雷公藤次碱 11088-09-8 868.30 178.10* -12 -60 -18 206.10 -12 -43 -20 *表示定量离子 1.3标准溶液的配制及样品前处理 标准溶液配制：取适量单标储备液，以乙腈配制成1000 ng/mL 的混合标准溶液，以以梯度初始浓度流动相逐级稀释配制标准溶液浓度系列。 前处理步骤：取1.0g蜂蜜至10mL离心管中，加入2mL水溶解，依次加入2mL乙腈、0.3g氯化钠、1.2g无水硫酸镁，涡旋振荡2 min， 8000 r/min 离心 5 min， 上清液经0.22um 有机相滤膜过滤后，进样分析。 结果讨论 2.1标准品的 MRM 色谱图 图3.0.05 ng/mL 雷公藤定碱和次碱混标色谱图 2.2线性关系 将浓度为0.01， 0.02，0.05，0.1，0.5，1.0，5.0和10.0 ng/mL 雷公藤定碱和次碱的标准工作液，按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法制作校准曲线，如图4~5所示，线性方程、线性范围和相关系数见表3. 图4.雷公藤次碱(wilforine) 图5.雷公藤定碱(wilfordine) 表3.雷公藤定碱和次碱的校准曲线参数 No. 名称 校准曲线 线性范围 相关系数r 准确度 (ng/mL) 范围(%) 图 6.0.01 ng/mL 混标色谱图 图7.空白样品色谱图 在10 ng/mL 混标分析结束后，空白样品进样考察 Carryover. 结果如图6和图7所示：在使用甲醇/乙腈/异丙醇/水=1：1：1：1 作为洗针液，洗针模式设置为 Rinse Port>Rinse Pump 时，可有效避免 Carryover. 2.3重复性实验 配制浓度为 0.01 ng/mL、0.5 ng/mL、10 ng/mL的混合标液，平行测试6次。雷公藤定碱和次碱的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.04~0.09%和1.19~6.01%之间，仪器精密度良好。 表4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) No. 样品名称 RSD% (0.01 ng/mL) RSD%(0.5ng/mL) RSD% (10 ng/mL) R.T Area R.T Area R.T Area 1 雷公藤定碱 0.09 6.01 0.06 4.08 0.04 1.42 2 雷公藤次碱 0.05 4.21 0.06 3.18 0.05 1.19 2.4灵敏度 配制浓度为 0.01 ng/mL的混合标样，直接进样分析，以 S/N=3 和 S/N=10定义仪器检出限 IDL 和定量限IQL。其中雷公藤定碱 IDL=0.0013 ng/mL， IQL=0.0043 ng/mL， 雷公藤次碱IDL=0.0027 ng/mL， IQL=0.009 ng/mL. 2.5基质加标实验 按照1.3中样品制备方法，在空白蜂蜜基质中添加混合标样，考察加标浓度为 0.05ng/g 和5ng/g时的回收率，测试结果见表5。空白基质的色谱图如图8所示，加标样品色谱图如图9和图10所示。 图8.空白蜂蜜基质色谱图 图9.蜂蜜基质加标0.05 ng/g色谱图 图10.蜂蜜基质加标 5 ng/g色谱图 表5.加标回收率 No. 化合物名称 空白样品含量 0.05 ng/g 5 ng/g (ng/g) 加标回收率(%) 加标回收率(%) 1 雷公藤定碱 - 104.0 99.6 2 雷公藤次碱 0.01 116.0 98.8 注：-表示低于定量限 结论 本文建立了一种使用岛津高效液相色谱和三重四极杆质谱联用技术同时测定蜂蜜中雷公藤定碱和次碱的方法，可快速、准确地测定蜂蜜中的雷公藤定碱和次碱含量。本文对目标物的线性关系、重复性、检出限和定量限及加标回收率进行了验证。结果表明，目标物的标 准曲线线性良好，相关系数均大于0.999，准确度范围在87.7%~113.8%，仪器定量限为0.0043 LCMSMS-205ng/mL~0.009 ng/mL。仪器的重复性良好，不同浓度混合标准溶液连续进样6次，保留时间和峰面积相对标准规偏差分别在0.09%和6.01%以下。空白蜂蜜基质加标经过前处理后，回收率在 98.8%~116.0%之间。 田岛津全球应用技术开发支持中心 本文建立了一种使用岛津高效液相色谱和三重四极杆质谱联用技术同时测定蜂蜜中雷公藤定碱和次碱的方法，蜂蜜样品以水溶解，乙腈盐析提取目标组分，离心，取上清液过滤后直接进样分析，可快速、准确地测定蜂蜜中的雷公藤定碱和次碱含量。本文对目标物的线性关系、重复性、检出限和定量限及加标回收率进行了验证。结果表明，目标物的标准曲线线性良好，相关系数均大于0.999，准确度范围在87.7%~113.8%, 仪器定量限为0.0043 ng/mL~0.009 ng/mL。仪器的重复性良好，不同浓度混合标准溶液连续进样6次，保留时间和峰面积相对标准规偏差分别在0.09%和6.01%以下。空白蜂蜜基质加标经过前处理后，回收率在98.8%~116.0%之间。