牛奶中己烯雌酚检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-360 Excellence in ScienceLCMSMS-255 咨询电话：021-22013542上海市淮海西路570号红坊E楼http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045测定牛奶中5种雌激素含量 LCMSMS-255 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用测定牛奶中雌酮、17β-雌二醇、雌三醇3种天然雌激素和己雌酚、己烯雌酚2种合成雌激素含量的方法。牛奶样品以乙腈沉淀蛋白，并超声萃取后，不需要经过衍生，样品在ESI 源负离子模式下电离， MRM 模式采集数据，外标法定量，校准曲线线性良好，线性相关系数均不低于 0.9993。对低、中、高不同浓度的样品平行测试6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.05~0.12%和0.42~8.26%之间，仪器定量限在 0.006~0.033 ng/mL。该方法前处理简单、灵敏度高、重复性好，可用于牛奶样品中雌激素含量的检测。 关键词：：三重四极杆质谱 LCMS-8045 牛奶 雌激素 负离子模式 雌激素属于类固醇类激素的一种，其在奶牛养殖业被广泛使用，以提高奶牛的产奶量，这种做法在提高经济效益的同时可能会使得雌激素在牛奶中残留。近年来，已经有大量研究证明：雌激素通过食物链进入人体可能会诱发乳腺、子宫、睾丸、骨、肾和其他一些组织的癌症。因此牛奶中雌激素的分析和检测具有十分重要的现实意义。 本文以雌酮(Estrone，E1)、17β-堆二醇(17β-Estradiol， E2)、雌三醇(Estriol，E3)、己雌酚分(Hexestrol， HEX)和己烯雌酚(Diethylstilbestrol， DES)为目标物，利用岛津LCMS-8045 建立了牛奶中雌激素含量的检测方法：牛奶样品以乙腈沉淀蛋白，并超声萃取后，不需要经过衍生，样品在 ESI 源负离子模式下电离， MRM 模式采集数据，外标法定量。该方法前处理简单、灵敏度高、重复性好，可用于牛奶样品中雌激素含量的检测。 HO 图15种雌激素分子结构式 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪LCMS-8045 联用系统。具体配置为 LC-30ADx2输液泵， DGU-20A5在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-30A 柱温箱， CBM-20A系统控制器， LCMS-8045三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.86色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GISS Column (2.1 mm I.D.×100 mm L.， 1.9 um C18) 流动相：A相-0.03%氨水溶液，B相-乙腈 流速：0.4mL/min 柱温：40℃ 进样量：5 uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，洗脱程序见表1。 表1梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.30 Pumps Pump B Conc. 20 0.50 Pumps Pump B Conc. 50 3.50 Pumps Pump B Conc. 50 3.70 Pumps Pump B Conc. 95 4.50 Pumps Pump B Conc. 95 4.60 Pumps Pump B Conc. 20 7.00 Controller Stop 质谱条件 离子化模式： ESI(-) DL温度：150℃ 加热气：空气12.0L/min 加热模块温度：350℃ 雾化气：氮气2.0 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气：氮气8.0L/min 驻留时间：100ms 碰撞气：氩气 延迟时间：3ms 接口温度：350℃ MRM参数：见表2 表2MRM优化参数 化合物 英文名 CAS No. 前体离子 产物离子 Q1 Pre CE (V) Q3 Pre Bias (V) Bias (V) 雌三醇 17β-雌二 Estriol (E3) 50-27-1 50-28-2 287.20 271.20 171.10* 20.0 40.0 27.0 145.10 20.0 47.0 22.0 17 B-Estradiol 145.10* 13.0 44.0 21.0 醇 (17β-E2) 183.20 28.0 45.0 30.0 Estrone 145.10* 30.0 41.0 25.0 雌酮 53-16-7 269.20 (E1) 143.00 13.0 66.0 12.0 己雌酚 Hexestrol 84-16-2 269.20 119.05* 19.0 43.0 18.0 (HEX) 134.10 19.0 16.0 11.0 己烯雌酚 6898-97-1 267.20 Diethylstilbestrol 251.10* 18.0 27.0 23.0 (DES) 237.10 18.0 31.0 22.0 注：*表示定量离子 1.3标准溶液的配制 标准溶液配制：将100 mg/L 混合标样储备液以 50%甲醇水溶液逐级稀释得到浓度分别为0.1、0.20.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL 的标准溶液。 1.4样品前处理方法 取 200 pL牛奶样品，加入800pL乙腈，涡旋振荡1 min， 超声萃取 20 min， 10000 rpm 离心3 min， 取上清液上机检测。 结果与讨论 2.1标准样品色谱图 图2(0.2 ng/mL 标准样品 MRM 色谱图 2.2线性范围 面积 面积 图3 校准曲线 将浓度为 0.1， 0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，50.0和 100.0 ng/mL 的4种目标物标准工作液，按1.2 中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法制作校准曲线，如图2所 LCMSMS-255示，线性方程、线性范围和相关系数见表3. 表3 校准曲线参数 名称 校准曲线 线性范围(ng/mL) 线性相关系数R 准确度(%) E3 Y=(7335.5)X+150.426 0.2-100 0.9999 96.01-103.4% E2 Y=(8932.6)X-2.7160 0.2-100 0.9999 95.5-104.7% E1 Y=(30778.2)X-18.0396 0.1-100 0.9998 94.7-104.9% HEX Y=(45714.2)X-376.316 0.1-100 0.9999 96.5-106.1% DES Y=(36057.1)X-196.210 0.1-100 0.9997 93.4-105.1% 2.3精密度实验 配制目标物浓度分别为0.2、5.0、100 ng/mL 的混合标样，平行测定各6次，考察仪器的重复性，保留时间和峰面积重复性结果如表4所示，仪器重复性良好。 表4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 名称 RSD (%， 0.2 ng/mL) RSD (%， 5.0 ng/mL) RSD (%， 100 ng/mL) R.T. Area R.T. Area R.T. Area E3 0.12 3.99 0.11 1.33 0.08 0.42 E2 0.12 5.34 0.09 1.48 0.06 0.54 E1 0.10 2.20 0.09 0.62 0.06 0.51 HEX 0.11 3.35 0.09 0.84 0.05 0.49 DES 0.08 8.26 0.09 1.62 0.05 0.39 2.4灵敏度实验 对目标物浓度为 0.20 ng/mL 标准溶液进样分析，由信噪比计算各目标组分仪器检出限(ILOD，S/N=3)和仪器定量限(ILOQ，S/N=10)，结果如表5所示。 表5检出限和定量限 名称 检出限(ng/mL) 定量限(ng/mL) E3 0.008 0.025 E2 0.007 0.021 E1 0.002 0.006 HEX 0.007 0.020 DES 0.010 0.033 2.5 回收率实验 将在超市购买的某品牌牛奶按照1.4对样品处理后进样分析，结果5种目标组分均未检出，如图4所示。在牛奶中添加5种目标组分，计算加标回收率，结果如表6所示。 图4阴性样品色谱图 250(x1.000) 图5空白基质加标 0.2 ng/mL 色谱图 表6 加标回收实验 名称 加标浓度 平均回收率 加标浓度 平均回收率 加标浓度 平均回收率 (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) E3 0.2 103.3 4.0 86.5 80 92.0 E2 0.2 87.8 4.0 103.3 80 106.0 E1 0.2 86.8 4.0 102.4 80 106.3 HEX 0.2 81.0 4.0 90.8 80 95.9 DES 0.2 83.3 4.0 102.9 80 109.4 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用测定牛奶中雌酮、17β-雌二醇、雌三醇3种天然雌激素和己雌酚、己烯雌酚2种合成雌激素 含量的方法。牛奶样品以乙腈沉淀蛋白，并超声萃取后，不需要经过衍生，样品在 ESI 源负离 LCMSMS-255子模式下电离， MRM 模式采集数据，外标法定量，校准曲线线性良好，线性相关系数均不低于 0.9993。对低、中、高不同浓度的样品平行测试6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.05~0.12%和0.42~8.26%之间，仪器定量限在0.006~0.033 ng/mL。该方法前处理简单、灵敏度高、重复性好，可用于牛奶样品中雌激素含量的检测。 田岛津全球应用技术开发支持中心 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用测定牛奶中雌酮、17β-雌二醇、雌三醇3种天然雌激素和己雌酚、己烯雌酚2种合成雌激素含量的方法。牛奶样品以乙腈沉淀蛋白，并超声萃取后，不需要经过衍生，样品在ESI源负离子模式下电离，MRM模式采集数据，外标法定量，校准曲线线性良好，线性相关系数均不低于0.9993。对低、中、高不同浓度的样品平行测试6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.05 ~ 0.12%和0.42 ~ 8.26%之间，仪器定量限在0.006~0.033 ng/mL。该方法前处理简单、灵敏度高、重复性好，可用于牛奶样品中雌激素含量的检测。