鱼肉中鱼肉中5种硝基咪唑类药物检测方案

Agela Technologies博纳艾杰尔产品应用案例 鱼肉中5种硝基咪唑类药物的分析方法AF10147 应用及技术服务部 摘要：本实验建立了鱼肉中5种硝基咪唑类药物残留的前处理方法，采用 Cleanert@ C18小柱结合液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS)对鱼肉中的5种硝基咪唑类药物进行了测定。样品经甲醇：丙酮=3：1(V/V)溶液提取，再经饱和氯化钠和乙酸乙酯液液萃取， Cleanert@C18小柱净化，以 5 mmol/L乙酸铵和甲醇为流动相进行梯度洗脱， LC-MS/MS 进行检测，外标法定量。结果表明，当加标量为1.0 ug/kg时，回收率在90%~110%之间，能够满足检测要求。 关键词：硝基咪唑； Cleanert@ C18； LC-MS/MS； 鱼肉 前言 硝基咪唑类(nitroimidazoles)药物具有抗原虫和抗厌氧菌活性，临床上主要用于治疗畜禽的厌氧菌感染和防治各种原虫病。体内外毒理试验证实，硝基咪唑类药物具有致畸、致突变和致癌作用。因此我国农业部规定禁止甲硝唑、地美硝唑作为饲料添加剂用于食品动物，禁止洛硝达唑用于所有食品动物的任何用途。 本文通过对前处理方法的优化，建立了鱼肉中5种硝基咪唑类药物同时测定的分析方法。 实验部分 仪器、试剂与材料 主要仪器设备 AB SCEIX API 4000*液相色谱串联质谱仪。 试剂材料 甲醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、乙酸铵均为色谱纯；；氯化钠为分析纯；；实验用水为超纯水； 5种硝基咪唑类药物勿合标准工作溶液：羟甲基咪唑、2-甲硝咪唑、、甲硝唑、洛硝 ( Email： s s e e r v ice@ag el a . com . cn 网址： w w w. ag ela . com . cn 客服：400-606-8099 ) 达唑、羟基二甲硝咪唑：甲醇溶解； CleanertC18固相萃取小柱：1000 mg/6 mL。 样品制备 样品提取 称取均质好的鱼肉样品20g 置于250 mL 具塞锥形瓶中，加入10g硅藻土与样品充分混匀，再依次加入5 mL饱和氯化钠溶液水溶液和70mL甲醇：丙酮=3：1(V/V)，高速均质 3 min。将提取液转移至离心管中，于10000 r/min 条件下离心 5 min， 将上清液转移至250 mL浓缩瓶中，剩余残渣用甲醇：丙酮=3：1(V/V)重复提取两次，合并提取液。将提取液用40℃旋蒸至只剩余水相，转移至分液漏斗中，加入50 mL饱和氯化钠和25 mL乙酸乙酯，振摇3min， 静置分层，收集乙酸乙酯相，水相再用20mL乙酸乙酯重复提取2次，合并乙酸乙酯相。再经约3g的无水硫酸钠脱水，收集于浓缩瓶中，40℃旋蒸至近干，加入5 mL 甲醇溶解残渣，并用 0.45 u.m Nylon 针式过滤器过滤，待净化。 样品净化 将 Cleanert@ C18小柱用5mL甲醇活化平衡，将上述待净化液全部上样于小柱上，收集流出液，再用10 mL甲醇洗脱小柱，收集流出液，合并两次流出液，， 于45℃下旋转蒸发至干，用流动相定容至1mL，待检测。 基质混合标准工作溶液 取高浓度硝基咪唑混合标准溶液，用空白样品基质溶液稀释成 0.02 ug/mL的基质混合标准工作溶液。 实验条件 色谱条件 色谱柱：Venusil MP C18，，3 um， 100 A， 3.0×50mm 流动相：A相-5 mmol乙酸铵溶液，B相-甲醇 柱 温：：30°C 进样量： 5pL 梯度洗脱条件(见表1) 表1.液相色谱梯度洗脱条件 ( 地址： 天 津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462 ) ( 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s s e e r v ice@ag el a . com . cn 网址： w w w .ag ela . com . cn 客服：400-606-8099 ) 时间(min) 流速(mL/min) A% B% 0.0 0.3 95 5 1.0 0.3 95 5 3.5 0.3 10 90 6.0 0.3 10 90 6.1 0.3 95 5 10.0 0.3 95 5 质谱条件 离子源： ESI+；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：50 psi；气帘气压力：25 psi；辅助气压力：50 psi；离子源温度：500℃；采集方式：多反应监测(MRM)。 表2.5种硝基咪唑类药物质谱参数 物质名称 Q1 Q3 DP/V CE/V 羟甲基咪唑 187.7 126.2 64.0 25.0 123.3 64.0 18.0 2-甲硝咪唑 128.2 82.2 88.8 24.7 111.2 88.8 23.6 甲硝 172.0 128.2 63.0 21.2 82.2 63.0 36.7 洛硝达唑 201.4 140.2 80.0 17.0 145.0 80.0 35.0 羟基二甲硝咪唑 157.8 140.2 50.0 17.0 55.1 50.0 27.0 注：“下划线”为定量离子。 结果与讨论 由表3可知，采用 SPE 结合 LC-MS/MS 的方法检测鱼肉中5种硝基咪唑类药物，加标回收率在90%~110%之间，且变异系数小于10%，能够满足检测要求。从图1来看，用 Venusil MP C18 色谱柱分离5种硝基咪唑类药物，分离效果良好。 ( Email： s s e e r v ice@ag el a . com . cn 网址： w w w. ag ela . com . cn 客服：400-606-8099 ) 表4.鱼肉中5种硝基咪唑类药物加标回收实验结果(添加水平 1.0 ug/kg) 物质名称 保留时间/min 平均回收率/% RSD/% 羟甲基咪唑 3.19 108.0 4.0 2-甲硝咪唑 5.14 102.3 6.6 甲硝唑 5.14 104.4 5.0 洛硝达唑 4.99 100.3 5.5 羟基二甲硝咪唑 4.48 92.0 2.7 图1.0.1 ug/mL 5 种硝基咪唑类药物混合标准溶液色谱图 结论 本实验建立了鱼肉中5种硝基咪唑类药物的前处理方法，并结合 LC-MS/MS对样品进行了检测。结果表明，对于加标量为 1.0 ug/kg 的鱼肉样品，加标回收率在90%~110%之间，满足检测要求，且变异系数小于10%，稳定性良好。说明该方法适用于鱼肉中5种硝基咪唑类药物的同时检检。 ( Email： s s e e r v ice@ag el a . com . cn 网址：ww w .agela.com.cn 客服：400-606-8099 ) 附：相关产品 产品名称 规格描述 包装数量 订货号 CleanertS C18 1000 mg/6 mL 30支/包 S180006 卓睿全自动固相萃取仪 4通道，24位 1台 SPE-40 Venusil MP C18 3 um， 100 A， 3.0×50 mm 1支 VA930503-0 1.5 mL样品瓶 短螺纹透明带书写处32×11.6 mm 100/pk 1109-0519 氮吹仪 15位 1台 NV15-G 1.5 mL样品瓶盖 9mm中心孔蓝盖，红色 橡胶/米色 PTFE 隔垫45° Shore A； 1.0 mm 100/pk 0915-1819 尼龙针式过滤器 单膜， 13 mm， 0.22um 200个/包 AS021320 一次性注射器 2 mL无针头 100支/包 LZSQ-2ML 地址：天津经济开发区西区南大街 邮编：话： 传真：