食品发酵液中氨基酸检测方案(液相色谱柱)

引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 中国印刷部件号5980-1193CHCN要了解有关我们产品的更多信息，请访问安捷伦科技公司的主页： www.agilent.com/chem/supplies。 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 快速、准确、灵敏、重现性好的HPLC氨基酸分析方法 安捷伦1100 HPLC与Zorbax Eclipse-AAA柱分析氨基酸 John W. Henderson， Robert D. Ricker， Brian A. Bidlingmeyer，Cliff Woodward 理想的氨基酸定量分析方法，运用了可靠的衍生化反应和分析技术，实现了快速和高灵敏度分析。自动在线衍生化与 HPLC相结合，其中一级氨基酸用邻苯二甲醛(OPA)、二级氨基酸用9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)进行衍生。安捷伦1100 HPLC方法使整个分析过程快速、准确、灵敏且重现性好。 快速柱前衍生化反应---氨基酸(AA)与OPA和FMOC发生衍生反应，然后进行色谱分析。酸水解后的蛋白质/多肽样品在pH 10.2的缓冲液中可以直接衍生化。在3-巯基丙酸(3-MPA)存在下一级氨基酸首先与OPA反应，而二级氨基酸不和OPA反应，然后再用FMOC进行衍生。加入的吲哚与3-MPA 相结合可降低氨基酸的疏水性，所以OPA衍生化产物比FMOC衍生化产物的色谱出峰时间更早。过剩的FMOC及其降解产物在二级氨基酸后出峰，不会干扰分析。衍生化过程快速，而且使用安捷伦1313A自动进样器可非常容易实现自 动化。由于反应速度的优势，两个衍 生化反应都能在室温下完成。自动衍生过程可提供较高的重现性。在柱长75-mm的色谱柱上，从两次进样之间的时间间隔仅需14分钟(分析运行时间仅10分钟)。在柱长150-mm的色谱柱上的总分析时间为26分钟(分析运行时间16分钟)。以上两种分析都提供较高的样品通量。 分离选项 Zorbax Eclipse-AAA柱的反相填料每批都经检验合格。按照本应用报告 具体操作步骤操作，可分离蛋白质/多肽水解产物中的常见氨基酸。 A和B流动相很容易制备，梯度洗脱具有一定的线性范围(详见流动相一节中的实验条件)。安捷伦1100HPLC二元或四元泵都可使用此方法。色谱图1：安捷伦1100 HPLC二元泵及二极管阵列检测器(DAD)得到的高通量应用中常见的灵敏度。在保证足够分辨率的前提下，一次完整的样品分析可在14分钟内完成(包括再平衡)。分离条件详见实验条件一节。 图1：常规分析： Eclipse-AAA 色谱柱高通量分离24种氨基酸。色谱柱尺寸为4.6 x 75 mm， 3.5 um。色谱峰列表见表1。检测器： A. 338 nm (OPA-氨基酸)，B.262 nm (FMOC-氨基酸)。 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 一级氨基酸 (OPA衍生)，338 nm检测见图1A，二级氨基酸(FMOC衍生)，262nm检测见图1B。进样量：每种125 pmoL的氨基酸进样0.5 uL。 表1.按Eclipse-AAA色谱柱上氨基酸的出峰顺序 峰号 氨基酸 缩写 天门冬氨酸 ASP 谷氨酸 天门冬酰胺 GLU ASN 丝氨酸 SER 谷氨酰胺 GLN 组氨酸 HIS 甘氨酸 节氧酸 GLY 爪酸 THR CIT 精氨酸 ARG 丙氨酸 ALA 酪氨酸 TYR 胖氨酸 CY2 缬氨酸 VAL 蛋氨酸 MET 正缬氨酸 NVA 色氨酸 TRP 苯丙氨酸 PHE 异亮氨酸 ILE 亮氨酸 LEU 赖氨酸 LYS 羟脯氨酸 HYP 肌氨酸 SAR 图2：21种氨基酸的高分辨分离：分别使用5 um和3.5 um Zorbax Eclipse-AAA柱。柱尺寸为4.6x 150mm。色谱峰的列表见表1。检测器：338 nm(OPA 氨基酸) 图3：不同的检测方式， Zorbax Eclipse-AAA 高灵敏度、高分辨分析氨基酸。柱尺寸为4.6x 150mm， 3.5 um 。色谱峰的列表见表1。检测：AUV338 nm(OPA 氨基酸)， B. UV 262 nm(FMOC-氨基酸)，C.荧光(详见实验条件)。 脯氨酸 PRO 如果希望比75-mm柱高通量分离时(图1)更高的分辨率，可使用150-mm的色谱柱。图2是在普通灵敏度下的高分辨分离，分别使用了两种不同填料粒径的150 mm Zorbax Eclipse-AAA色谱柱---3.5 um填料与5 um填料。一级氨基酸OPA衍生化产物的338 nm色谱图。谱图性能相近，但3.5-um 色谱柱由于具有较高的柱效因此分辨率更高。 图4： Eclipse-AAA高分辨分离24种氨基酸，常规分析。柱尺寸为4.6x150mm， 5 um 。色谱峰的列表见表1。检测： AUV338 nm (OPA 氨基酸)， B.UV262 nm(FMOC-氨基酸)。 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 3.55um较小填料的色谱柱柱后压为240-300bar(3530-4410 psi)，而5 um柱的柱后压为160-210 bar(2350-3090 psi)。因此，如果只分离一级氨基酸，使用15-cm色谱柱时，则选用较大的5-um填料，此时系统的柱后压较低。 图3和图4，可以清楚地对比15-cm. 3 .5-um 柱和5-um 色谱柱。图3A：检测波长338 nm， 分离一级氨基酸；图3B：检测波长262 nm；图3C：荧光检测。注意图3和图4中峰21(赖氨酸)和峰22(羟脯氨酸)的分离度。使用粒径较小填料、较长的色谱柱(150 mm， 3.5 um)时，色谱峰的分离度增加，同时为峰21和峰22之间进行DAD波长或荧光检测切换提供了足够的时间窗口。 用262 nm检测(图3B)时，衍生副产物导致在7到10分钟之间的基线隆起一个小包。由于此时只需检测一级氨基酸(338nm)，这个隆起的小包不会影响其检测或分辨率。最好在两个波长下都检测二级氨基酸，如羟脯氨酸。否则，可进行波长切换。 由于检测时的温度、流动相等会发生变化，荧光(或UV)波长切换的时间可能略有不同。图3C荧光光测：450nm (Ex = 340 nm)，在峰21赖氨酸峰流出后，峰22(羟脯氨酸)出峰前，切换波长到305 nm。 波长切换编程在15分钟时切换波长。详见实验条件一节中的检测设置。24#(脯氨酸)出峰后，升高梯度到100%B相，以洗出柱内的衍生化反应副产物。100%B洗 脱3.7分钟后，回到初始条件，为下一次进样平衡色谱柱。注意在荧光检测的色谱图中，峰13(胱氨酸)没有荧光，因此无法被检出。 赖氨酸-羟脯氨酸的分离与波长切换 赖氨酸和羟脯氨酸的分析对检测参数的选择、色谱柱配置，乃至运行时间有重大影响。在羟脯氨酸之前被洗脱出来的氨基酸(包括赖氨酸)都是用OPA衍生，338 nm检测。赖氨酸出峰后，羟脯氨酸立刻被洗脱下来，这是第一个用FMOC衍生的氨基酸，必须用262nm检测。最简单的解决方案：使用安捷伦1100 DAD或MWD(多波长检测器)分别连续收集338 nm和262 nm 两个波长的信号。 如果没有DAD和MWD，收集单通道信号的波长可以在精心选择的条件下进行切换，以检测OPA和FMOC衍生的氨基酸。可以用一个通道进行数据收集，例如，使用安捷伦1100 VWD (可变波长检测器)。如果使用更复杂的梯度洗脱，还可提高赖氨酸和羟脯氨酸的分辨率。要了解其它信息，请上网查寻www.agilent.com/chem“Technical Support”“User ContributedSoftware” 如果羟脯氨酸不是感兴趣的待测物(例如，分析蛋白质水解产物)，则可以使用任何色谱柱配置，并在赖氨酸和第一个FMOC-氨基酸(肌氨酸或脯氨酸)之间进行波长切换。在这种情况下，可以使用4.6x 75mm 尺寸的色谱柱，分析时间能节省一半。 与HP 1090 HPLC上的 AMINOQUANT方法作比较 图5A是在HP 1090 HPLC上用特定的流动相、色谱柱和流速，按照原来的AminoQuant方法(应用报告， HP出版号 5954-6257)得到的色谱图。在这一分离中有5对难分离的氨基酸(asp/glu， his/gly， ala/arg， val/met 图5：氨基酸分析方法的比较。 A) 用 Hypersil AA 木在 HP1090 HPLC上使用AminoQuant 方法。B)用Zorbax Eclipse-AAA 主(4.6x150 mm， 5 pm) 在安捷伦1100 HPLC 上进行分析。 and phe/ile)。其中 asp/glu 这一对氨基酸的色谱峰与死体积非常接近。 图5B是用Zorbax Eclipse-AAA柱得到的色谱图。所有难分离氨基酸对的分辨率都得到了改善，特别是第一对，asp/glu，现在延长了保留时间，能与色谱柱的死体积明显分开。而且，同样在HP 1090仪器上，用Eclipse-AAA柱和用原来的AminoQuant 方法相比，精氨酸在丙氨酸前出峰。 重现性 表2显示了在Zorbax Eclipse-AAA柱(4.6 x 150 mm， 3.5 um)上对氨基酸衍生化后混合物连续进样(n=6)的分析结果。每次都进行单独衍生化和色谱分离。保留时间重现性相当好，平均相对标准偏差 (%rsd)为0.18%。衍生化反应的重现性用峰面积表示，平均%rsd为2.0%。这些数据与在HP1090上用原来的AminoQuant 方法得到的结果相当(分别为0.23%和2.3%，参见LC/GC Inter-national 第5卷第2期，1992年2月，第44到49页)。 线性和灵敏度 Eclipse-AAA分析氨基酸标样(0.5ul)的线性范围是4.5 pmoL到450pmoL. 图6显示了几种氨基酸用DAD或FLD检测的校正曲线。无论用DAD还是FLD检测器进行校正，所有244种氨基酸的相关系数都在0.99900和1.00000之间。 5 pmol和50 pmol两个低浓度的衍生化氨基酸，分别用 DAD 和FLD检测，分析结果见图7和图8。用DAD(图7)，每种氨基酸均约在10 pmol左右能够检出。用FLD(图8)灵敏度比DAD 更高。 性与原来的 AminoQuant 方法相当，流动相的制备更简单，只需要调节缓冲液(A相)pH值。 色谱柱的选择取决于所需要的分析速度和分辨率： 峰面积 %rsd ASP 0.8 GLU 3.0 ( ZORBAX Eclipse-AAA 4.6x 75 mm (3.5 um) 用DAD适用于普通灵 敏度、高通量分析。 ) ASN SER GLN HIS GLY 2.5 THR CIT 3ARG 2 ALA 0.9 TYR 0.7 CY2 0.6 0.5 MET NVA 07 TRP 0.8 PHE ILE LEU LYS HYP 4.2 SAR PRO 2.0 表2： Zorbax Eclipse-AAA分析氨基酸的重现性。四元泵的安捷伦1100系统。重复分析六次所得结果。 图6：氨基酸衍生化产物分析的校正曲线，A用UV检测，B用FLD检测。线性范围为0.5 u1样品4.5到450pmol。 结论 经OPA和FMOC化学衍生，用ZorbaxEclipse-AAA柱和安捷伦1100HPLC， 蛋白质和多肽水解产物的氨基酸分析可以在10分钟内完成。本方法与原来在HP1090 HPLC系统上的AminoQuant方法相比，5个难分离氨基酸对的保留得到了改善。在Eclipse-AAA柱上氨基酸分析的重现 ZORBAX Eclipse-AAA 4.6 x150mm(5 um) 用DAD适用于普通灵敏度、较低柱后压，高分辨率分析。ZORBAX Eclipse-AAA 4.6x 150mm (3.5 pm)用FLD适用于高灵敏度、高分辨率的分析。 ZORBAX Eclipse-AAA 3.0 x 150mm， (3.5 um)，2000秋上市，适用于 图7： UV检测器338 nm检测时不同浓度氨基酸的响应(OPA衍生化产物)。 图8：荧光检测器检测时不同浓度氨基酸的响应。光电倍增器管的增益=10。 样品和溶剂消耗较少的高灵敏度、高 仪器分辨率分析。 色谱仪器系统：安捷伦1100 HPLC， 使用安捷伦1313A自动进样器，可以进行自动柱前衍生操作，加快了速度，提高了反应的重现性，并将操作污染减到最小。这个分析方法适用于用DAD和收集双波长数据，或进行编程波长切换，对一级和二级氨基酸的常规分析。如果要进行高灵敏度分析，需要适用荧光检测器。 G1312A 二元泵、G1315A1二极管阵列检测器(DAD)、6-mm或10-mm流通池，和/或G1315A荧光检测器(FLD)。此条件同样适用于安捷伦1100四元泵 (G1311A )。 HPLC色谱柱 ZORBAX Eclipse-AAA 4.6 x 75 mm， 3.5 um PN 966400-902 实验条件 ZORBAX Eclipse-AAA 用下列实验条件得到的色谱图见图1-8： 4.6x 150 mm， 3.5 umPN 963400-902 ZORBAX Eclipse-AAA3.0 x 150 mm， 3.5 um 2000秋上市*保护柱应使用一个低死体积的连接头直接连接到分析柱上。 流动相 泵的设置 流速：2mL/min 停止时间：14分钟(75-mm柱)或26分钟(150-mm柱) 柱后时间： off 辅助泵设置： 最大流量程序：100 mL/min² 压缩性A： 50x 10-6 最小冲程A：20 pL 压缩性B：115x 10-6 最小冲程B：自动 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 梯度： 适用于75 mm柱长 时间(分钟) %B00 9.8 10010012.514 适用于150mm 柱长 注：当色谱柱将过夜或更长时间不用时，用10个柱体积的100%B冲洗色谱注，可延长柱寿命。 检测器设置 DAD： 所需光源： UV灯：需要 可见灯：不需要 UV：338 nm， 10 nm带宽(bw)，参比：390 nm， 20 nm bw(适用于OPA-氨基酸) 262 nm， 16 nm bw，参比：324 nm，8 nm bw (适用于FMOC-氨基酸)峰宽：>0.03分钟(0.5秒)狭缝：4nm FLD： *切换荧光波长的具体时间可能因温 样品瓶：度和流动相等的变化而异。 峰宽：>0.5分钟 参见样品瓶的位置(图9) 进样器程序：从瓶1中吸取2.5 uL (硼酸盐缓冲液)吸取0.5uL样品(如，口可选择11号为本件品)“在空气中”混合3pL，最大速度，2 次等待0.5分钟从瓶2中吸取0pL(用未加盖瓶中的水清洗针头)从瓶3中吸取0.5uL (OPA)“在空气中”混合3 uL，最大速度，6次从瓶2中吸取0 uL(用未加盖瓶中的水清洗针头)从瓶4中吸取0.5 uL(FMOC)“在空气中”混合4uL，最大速度，6次[当用于高灵敏度分析时可选择针头清洗：从瓶6中吸取0.0 uL (ACN， 乙腈)]从瓶5中吸取 32 uL(水)“在空气中”混合18uL，最大速度， 2次 进样 图9：安捷伦1313A自动进样器上样品瓶的位置。 该样品瓶位置为所列的进样器程序而设计。 辅助： 吸液速度200 pL/min 喷液速度 600 uL/min 吸液位置0.0mm 需要使用带聚合物支架的锥形内衬管(图10A)装盛 OPA 和FMOC试剂。 图10：内插管、样品瓶和瓶盖。氨基酸分析时安捷伦1100自动进样器上使用的锥形内插管A (安捷伦 PN 5181-1270)，棕色广口样品瓶B(安捷伦PN5182-0716)，螺纹盖C(安捷伦PN5182-0721)。 由于体积有限，内插管适用于广口螺纹或钳盖样品瓶(图10B-C)。但不能使用卡口瓶，因为FMOC 挥发性强，OPA 在氧存在下缓慢降解，这两种试剂都对密封垫密闭性要求很高。注意不要使用为其它仪器设计的样品瓶或瓶盖，否则可能损坏安捷伦 G1313A自动进样器。 柱温箱： 温度：40℃(左侧和右侧)适合分析：温度在设定点+/-0.8℃之间 衍生化试剂 硼酸盐缓冲液：安捷捷PN 5061-33390.4N水溶液，pH 10.2. 冷藏(4℃)，如有必要可分装。 FMOC试剂： 安捷伦PN 5061-3337 从1-mL FMOC中吸100-uLFMOC，加入到锥形内插管中，立即盖封，冷藏(4℃)；分装后的溶液最多可以使用7-10天。 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 OPA试剂： 安捷伦PN 5061-3335 从1-mL OPA中吸100-pLOPA， 加入到锥形内插管中，立即盖封，冷藏(4℃)；分装后的溶液最多可以使用7 -10天。 水：去离子水， HPLC级 规格和部件号见订购信息。 样品制备 注：样品瓶必须每天更换。每个1 mL安部瓶中所含的溶液可供10天使用(1000 pL/100 pL=10天)。 用于色谱对照的氨基酸混合液氨基酸色谱分析时，250 pmol/uL的17种氨基酸混合标样(PN：：5061-一3331)，加上瓜氨酸和6种补充氨基酸，浓度约250 pmol/uL。混合液由下列两种储备液制备而成。将1uL补充氨基酸储备液加至装有新取的250 pmol(100pL)标准的锥形内插管中。用旋涡混合器混合，配制成24种成分的标样，以备进样(250 pmol/L)。 250 pmol标准： 将1mL安部瓶的250pmol/pL氨基酸(PN 5061-3331)分装成各100uL，装入样品瓶的锥形内插管中，盖封，4℃冷藏。 补充氨基酸储备液： 称取试剂盒(PN 5062-2478)中的补充氨基酸(gln， asn， trp，nva， hyp， sar)各0.25 mmol，置20-mL瓶中。加入5 mL去离子水，在热水浴中超声，使 其溶解。再加5 mL水稀释。冷藏保存(4℃)。将同样浓度的瓜氨酸(Sigma-Aldrich Co.， St. Louis， MO)加入到混合液中。 保存时不要让补充氨基酸与氨基酸标样混合。因为某些补充氨基酸会在HCl中降解(特别是谷氨酰胺，天门冬酰胺也有一定程度的降解)。 用于绘制校正曲线的氨基酸混合液 各种浓度的17种氨基酸，加上4种补 充氨基酸，与固定量的内标(ISTD)一 起，用于建立校正曲线。内标(正缬 氨酸和肌氨酸)是补充氨基酸试剂盒(PN：5062-2478)的一部分。试剂盒中的其它氨基酸(gln， asn， trp， hyp)为补充氨基酸(补充氨基酸)。参见表3和表4，配制低灵敏度和高灵敏度的标样。 氨基酸标样(10pmol/uL 到1nmol/uL)：从PN5061-3330到5061-3334的1mL安部瓶标示中各取100pL，置于样品瓶内插管中，盖封，4℃冷藏。根据实验需要，校正曲线可用2至5个标样绘制。 补充氨基酸储备液： 该溶液由补充氨基酸试剂盒(PN：5062-2478)中6种氨基酸中的4种氨基酸组成。用于低灵敏度标准(表3)时，制成含谷氨酰胺、天门冬酰胺、色氨酸、4-羟基法脯氨酸18 nmol/uL的去离子水溶液25-mL。超声处理直至溶解。4℃冷藏保存。用于高灵敏度标准(表4)时，将18 nmol/uL溶液 用45 mL去离子水稀释5倍，制成1.8nmol/uL 溶液。 内标 (ISTD)储备液：用补充氨基酸试剂盒(PN：5062-2478)六种氨基酸中的两种制成。用于低灵敏度(表3)时，制成含正缬氨酸和肌氨酸10 nmol/uL的去离子水溶液25-mL。超声处理直至溶解。冷藏保存(4℃)。用于高灵敏度(表4)时，将5 mL 10 nmol/uL标样用45mL去离子水稀释成1 nmol/pL，冷藏保存(4℃)。 其他支持 通过安捷伦网站可以下载用户为各种类型色谱柱、书写文件提供的方法文件，以及氨基酸报告和宏。www.agilent.com/chem，“Technicall Supportlc”/”UserContributed Software” 表3：低灵敏度氨基酸标准溶液的制备。按所示体积混合储备液配制三种低灵敏度标样。 最终溶液的氨基酸浓度(pmol/pL) 900 225 90 取5 mL 18nmol补充氨基酸 5mL 5mL 5mL 用0.1NHCl 稀释 15 mL 45 mL 稀释后的补充氨基酸混合液 5mL 20 mL 50 mL 取5mL稀释后的补充氨基酸混合液 5mL 5mL 5mL 加10 nmol ISTD 溶液 5mL 5mL 5mL 补充氨基酸 -ISTD混合液 10 mL 10mL 10mL 取100uL补充氨基酸-ISTD混合液 100 uL 100 uL 100 uL 加1000 pmol 氨基酸标样 900 pL 加250 pmol 氨基酸标样 900 pL 加100 pmol 氨基酸标样 900 uL 含补充氨基酸和500 pmol/uL ISTD 的最终氨基酸 1mL 1mL 1mL 表4：高灵敏度氨基酸标准溶液的制备。按所示体积混合储备液配制三种高灵敏度标样。 最终溶液的氨基酸浓度(pmol/pL) 90 22.5 9 取5 mL 1.8nmol补充氨基酸 5mL 5mL 5mL 用0.1NHCl稀释 15 mL 45mL 稀释后的补充氨基酸混合液 5mL 20 mL 50 mL 取5mL稀释的补充氨基酸混合液 5mL 5mL 5mL 加 1nmol ISTD溶液 5mL 5mL 5mL 补充氨基酸 -ISTD 混合液 10 mL 10 mL 10 mL 耳 100mL补充氨基酸-ISTD 混合液 100 uL 100 pL 100 uL 加100 pmol 氨基酸标样 900 pL 加25pmol氨基酸标样 900 uL 加10 pmol氨基酸标样 900 uL 含补充氨基酸和50 pmol/mL ISTD 的最终氨基酸 1mL 1mL 1mL 订购信息 Eclipse-AAA HPLC柱 Eclipse-AAA HPLC柱 规格 尺寸 粒径 安捷伦 (mm) (um) 部件号 分析，普通灵敏度， 高分辨 4.6x150 5 um 993400-902 分析，高灵敏度、高分辨， 使用FLD 4.6x150 3.5 pm 963400-902 分析，普通灵敏度， 高通量 4.6x75 3.5 pm 966400-902 分析，高灵敏度，高分辨， 使用DAD或FLD 3.0 x 150 3.5 um 961400-302 保护柱(4/包) 4.6x12.5 5 um 820950-931 保护柱硬件工具包 820777-901 衍生化试剂 部件号 硼酸缓冲液：0.4M水溶液， pH 10.2，100 mL5061-3339 FMOC试剂，2.5 mg/mL乙腈溶液，10x1mL安部瓶 5061-3337 OPA试剂，10 mg/mL溶于0.4M硼酸缓冲液和 3-巯基丙酸，6x1mL安瓿瓶 5061-3335 分析半胱氨酸用的 DTDPA试剂，5g 5062-2479 样品瓶 规格 安捷伦 部件号 100 uL带聚合物支架的锥形内插管，100/包 5181-1270 棕色、广口、带书写处、螺纹盖样品瓶 2 mL， 100/包 5182-0716 绿色螺纹盖， PTFE/硅橡胶密封垫，100/包 5182-0721 标准品 氨基酸标样溶于0.1M HCl， 10 x 1mL安部瓶 Nva， Sar， Asn， Gln， Trp， Hyp， 各1g 5062-2478 其它支持 其它支持 类别 用户提供的化学工作站方法文件、定制的氨基酸报告和宏、其它文件，均可从网上下载： www.agilent.com/chem，“Technical Supportlc”/“UserContributed Software”. 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 安捷伦公司版权所有。未经许可不得翻印、改编或翻译。 Agilent Technologies 24种氨基酸分离Zorbax eclipse AAA 4.6x150x5umA: 40mM Na2HPO4 PH 7.8,B: 乙腈:甲醇:水=45:45:10流速2ml/min时间(min) %B0             01.9          018.1       5718.6      10022.3      10023.2        026           0