透明质酸钠中透明质酸检测方案(液相色谱柱)

INFORMATIONTECHNICALTSKgelNo.179 参照《日本药典》第十七改正版中透明质酸的分析 透明质酸是D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖双糖单元结合形成的一种线型葡糖胺聚糖。据称其分子量可达百万以上。它是从鸡冠中分离或由微生物合成而得的生物材料，由于具有弹性和保水性，在医疗领域也得到广泛应用。典型应用实例有滴眼剂(干眼症用眼药、眼科手术佐剂)、关节功能改善剂(注射治疗关节疼痛)和内窥镜用粘膜下注射材料等。 日本药典第十七改正版(2016年4月)中的药品专论新收载了“精制透明质酸钠滴眼液”和“精制透明质酸钠注射液”。其中“精制透明质酸钠滴眼液”的定量检测方法采用 HPLC 法。所收录的方法是使用小分子分析用 SEC 色谱柱，将透明 质酸在排除极限溶解量附近洗出，用该色谱峰面积进行定量计算。 本报告介绍了依据日本药典第十七改正版，对透明质酸钠进行分析并确认系统合适性的实例。 分析色谱柱使用的是适合定量检测法试验条件的色谱柱TSKgel G2500PWxL(7.8 mml.D. x300 mm，7 um)。在被收录的分析条件下，将流量设定为1.0 mL/min，透明质酸的保留时间为5.1分钟。 系统合适性确认结果为：1)透明质酸和内标物e-氨基己酸 (IUPAC名：6-氨基己酸)的洗脱顺序、2)透明质酸和e-氨基己酸的色谱峰分离度、3)重复测试时的透明质酸的峰面积相对标准偏差等项目都合格。 表1日本药典收录的定量检测方法试验条件 色谱柱：在内径7.8mm、长度30cm的不锈钢管中装填液相色谱用7pm多孔聚甲基丙烯酸酯。 流动相：将32.2g十水硫酸钠溶解于水，制成1000 mL溶液 流量量：将透明质酸的保留时间调节为约5分钟 柱流温：40℃左右的恒温 检测器：紫外吸收光度计(测量波长：210nm) 表2分析条件 nstrument： Agilent 1200SL series Column： TSKgel G2500PWxL (7.8 mml.D.x300 mm， 7 pm) Eluent： 1.0 mol/L Sodium sulfate Flow rate ： 1.0 mL/min Column temp.： 40 C Injection volume： 20 pL Detector ： UV 210 nm 图1系统合适性试验样品色谱图 表3系统合适性试验 系统合适性试验用溶液： 将50mg精制透明质酸钠溶解至50 mL氯化钠溶液(9→1000)中。 量取1mL该溶液和2 mLe-氨基己酸溶液(1一500)，加入流动相，制成20mL溶液。 系统合适性试验规定 1.按顺序洗脱透明质酸、e-氨基己酸 →规定的洗脱顺序 2.透明质酸和e-氨基己酸的分离度不小于5 一分离度9.0 3.每进样20 uL，重复6次时的透明质酸的峰面积相对标准偏差不超过2.0% →相对标准偏差为0.29% 表4重复6次测试时的色谱峰面积值 Run Peak area(mABU·sec) 1st 43.172 2nd 42.865 3rd 43.098 4th 43.126 5th 43.039 6th 42.902 Average 43.034 RSD(%) 0.29 本报告介绍了参照《日本药典》第十七版使用TSKgel G2500PWXL色谱柱对透明质酸钠进行HPLC分析实验。