动物源食品中氨基糖苷类抗生素检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific 热线8008105118电话4006505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。◎2018 Thermo Fisher Scientific Inc.保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 LC-MS/MS结合离子色谱电解再生膜抑制器技术快速检测动物源食品中14种氨基糖苷类抗生素残留 徐媛，陈达，钟新林，徐牛生，赛默飞世尔科技(中国)有限公司 摘要 本文在Thermo ScientificTM全新液相色谱串联三重四极杆质谱平台Thermo ScientificTM TSQ FortisTM上联用离子色谱电解再生膜抑制器技术，建立了快速检测动物源性食品中14种氨基糖苷类抗生素(AGs)残留的方法。流动相中加入了七氟丁酸(HFBA)和三氟乙酸(TFA)等离子对试剂，采用Thermo ScientificTM Ac-claim AmG C18氨基糖苷类专用柱，14种氨基糖苷类抗生素保留良好，分离快速。通过赛默飞离子色谱专利的电解再生膜抑制器技术，将HFBA和TFA酸根离子在进质谱前去除掉，降低污染，提高灵敏度；通过柱后加入氨水，进一步提高响应。14种AGs在相应浓度范围内线性关系良好(R2>0.99)， LOD及LOQ超出相关国标规定的检测要求，其中LOQ连续6针的RSD均小于14%，重复性良好，本方法优于国标方法。 前言 氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside antibiotics，AGs)是一类广谱高效的抗生素，用于治疗革兰氏阴性菌引起的感染，在农业、养殖业及医疗等领域均有广泛应用。此类抗生素由两个或多个氨基糖基团通过糖苷和氨基环多醇键合而成成，极性大，易溶于水，脂溶性差，人体和禽畜的胃肠道不易吸收，通过肌肉注射后大部分以原药经肾排泄，通过粪肥可能迁移至土壤及周围水体中，最终进入食物链，对动物和人体健康及生态系统构成潜在威胁。由于此类化合物极性极大，常规色谱保留弱，无紫外吸收或紫外吸收弱，业内目前也没有特别成熟稳定且灵敏的检测方法。 国标GBT21323-2007《动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》中使用了100mM七氟丁酸(HFBA，\，离子对试剂)结合常规的C18柱即可实现对这类化合物的很好保留。但HFBA和TFA(三氟乙酸)这类离子对试剂 负离子响应极强，进到质谱中极易残留且不容易洗掉。残存在离子源区后，会长期影响负离子化合物的检测灵敏度。业内质谱应用中，'，一般不建议在流动相中添加这类离子对试剂。此国标中，检测的10种氨基糖类抗生素分别为壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、新霉素、潮霉素B、安普霉素，线性范围中的线性低点为50ppb(前7种， LOQ为20 pg/kg)和300ppb(后3种， LOQ为100ug/kg)，灵敏度不高。 本文基于Thermo ScientificTM VanquishTM Binary Horizon与Ther-mo ScientificTM TSQ FortisTM三重四极杆质谱仪联用技术结合赛默飞离子色谱专利的电解再生膜抑制器技术建立了快速检测动物源食品中14种氨基糖苷类抗生素残留的方法。此方法也在流动相中添加了HFBA和TFA等离子对试剂以增强这些化合物的保留性质，结合Thermo ScientificTM AcclaimTM AmG C18 氨基糖苷类抗生素检测的专用柱(可耐pH范围0.5~10)，再通过电解再生膜抑制器技术可有效去除流动相中的三氟乙酸根和七氟丁酸根，从而避免污染质谱，并显著提高响应。应用此方案，测试了猪肉中14种氨基糖苷类抗生素(包含国标中的10种)，样品前处理方式与国标一致，灵敏度满足国标要求，且LOQ连续6针的RSD均小于14%，说明本方案可靠、稳定、灵敏。 实验方法 1.仪器与试剂 ( 1 . 1 Thermo ScientificTM VanquishTM Binary Horizon超高效液相色 谱仪 ) ( 1.2 Thermo Scientif i cTM TSQ FortisTM三重四极杆质谱仪 ) 1.3 Thermo ScientificTM Aquion离子色谱，带CSRS300 4mm抑制器及电导检测器 1.4乙腈(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)；实验用水为Milli-Q去离子水； HFBA(色谱纯25g， SIGMA)， TFA(色谱纯100mL， SIGMA) 2. 实验方法 2.1色谱方法 色谱柱：Thermo ScientificTM AcclaimTM AmG C18 column (150mm*2.1 mm， 3 pm)；柱温：35℃；进样量：5pL；抑制器电流：150mA；抑制器再生水流速：1mL/min。 流动相A为5mM HFBA&100 mM TFA 水溶液，B为80%ACN &20%Water， 梯度洗脱程序见表1。抑制器后端接一个三通，引入一路5%氨水，流速为0.1 mL/min。 表1.梯度洗脱程序 Time(min) Flow Rate(mL/min) A% B% 0.0 0.5 100 0 1 0.5 100 0 12 0.5 85 15 15.0 0.5 85 15 15.1 0.5 100 0 21 0.5 100 0 2.2质谱方法 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；监测模式：选择反应监控(SRM)；喷雾电压：4000V；鞘气压力：40Arb；辅助气压力：10Arb；蒸发温度：400℃；离子传输管温度：320℃；碰撞气压力：1.5 mTorr；选择反应监测离子对信息见表2。Cycletime为2 s， Chromatographic Peak Width为40 s， Q1和Q3分辨率分别为0.7和1.2。 表2.14种化合物及质谱采集信息 Com- Precursor Product Collision Tube Lens (V) Source pound (m/z) (m/z) Energy (V) Frag- mentati- on (V) CMS 528.288 177.083* 27.83 122 23 CMS 528.288 352.054 22.52 122 23 AMKX 586.3 264.179 25.56 134 o AMKX 586.3 425.226* 18.1 134 KNMS 485.2 163.095* 24.17 167 0 KNMS 485.2 324.071 15.83 167 0 LMS 600.25 263.125 34.78 Calibrated TF 5 LMS 600.25 582.196* 17.89 Calibrated TF 5 SQLMS 584.35 246.196 37.6 112 0 SQLMS 584.35 263.071* 30.36 112 0 DGMS 351.18 207.11 22 Calibrated TF 5 DGMS 351.18 333.11* 19 Calibrated TF 5 APMS 540.275 217.113* 26.57 145 8 APMS 540.275 378.19 16.58 145 8 TBMS 468.238 163.167* 22.61 127 TBMS 468.238 323.905 13.68 127 0 XSMX 448.3 254.196* 20.29 160 0 XSMX 448.3 322.113 12.12 160 0 XMS 615.375 293.042* 23.45 128 29.4 XMS 615.375 323.042 21.39 128 29.4 BLMS 308.388 161.333* 10.48 52 0 BLMS 308.388 163.149 18.65 52 NTMX 476.3 299.208* 19.24 141 5 NTMX 476.3 458.25 13.26 141 5 YTMX 478.338 191.042 23.53 Calibrated TF 5 YTMX 478.338 350.196* 14.48 Calibrated TF 5 QDMS 478.35 157.161 21.18 125 14.7 QDMS 478.35 322.054* 13.47 125 14.7 注：标“*”为定量子离子 3.猪肉基质前处理 前处理过程参考GBT21323-2007中“7.1提取”和“7.2净化”，具体如下： 提取：称取约5g(精确至0.01g)试样于50 mL聚丙烯离心管中，加入10nmL磷酸盐缓冲液均质2min， 于平板振荡器上振荡提取10min， 离心10 min (4500 r/min)， 将上清液转移到另一个50mL聚丙烯离心管中。在残渣中再加入10 mL磷酸盐缓冲液，重复上述操作，合并上清液，用1mol/L的盐酸调pH值为3.5±0.2，加入2mL七氟丁酸溶液，涡旋混匀。 净化：C18固相萃取柱用3mL甲醇，3mL七氟丁酸溶液淋洗后，将提取液加载在固相萃取柱上，控制流速约1滴/s，先用3mL七氟丁酸溶液淋洗，再用每次3mL水淋洗两次，弃去淋洗液，抽干5min。用5mL乙腈-七氟丁酸溶液(80+20，体积比)洗脱，手机洗脱液于精密刻度试管中，40℃氮气流挥去部分溶剂，用七氟丁酸溶液定容至1mL，涡旋混匀后，过0.2pm微孔滤膜，上机测定 4.基质标曲配制 用初始流动相即5mM HFBA&100)1mMTFA 水溶液分别配制100ppm的14种化合物(潮霉素、阿米卡星、安普霉素、巴龙霉素、卡那霉素、链霉素、奈替米星、庆大霉素、大观霉素、双氢链霉素、妥布霉素、新霉素、西索米星、依替米星)的单标1mL备用，各取5uL(14个)加到930uL上述配制而得的空白基质中，获得500ppb含14种化合物的基质混标，再用空白基质将其逐步稀释，配制0.5ppb、1ppb、2ppb、5ppb、10ppb、20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb系列标曲点。 5.数据采集与处理软件 液相控制软件： Thermo Foundation3.1， Thermo ScientificSIl for Xcalibur； 质谱控制软件： TSQ Fortis Tune Application3.1.2415.15；数据采集工作站及数据处理软件： TraceFinder 4.1SP4 1.赛默飞离子色谱专利的电解再生膜抑制器技术原理 图1和图2分别为电解再生膜抑制器的实物图与工作原理图。在图2原理图中，两边是选择性透过膜，中间为流动相通道，通过电解水作用，在阴极产生OH-置换出流动相中的TFA-和HFBA-，直接从阳极排到废液。 TFA-和HFBA-与分析物离子结合，生成的离子对化合物较为稳定，影响分析物在质谱中的电离，显著降低灵敏度。且流动相 中的TFA和HFBA对质谱系统(离子源、喷针等)有吸附腐蚀作用， TFA-和HFBA-残留在质谱离子源区难以完全洗干净，其负离子响应极高，会竞争抑制后续负离子化合物的检测灵敏度。采用赛默飞离子色谱专利的电解再生膜抑制器技术可以有效去除流动相中的三氟乙酸根和七氟丁酸根离子，从而避免污染，并显著提高分析物的检测灵敏度。 图1电解再生膜抑制器的实物图 图2电解再生膜抑制器的工作原理图 2.灵敏度和线性范围测试 采用上述仪器分析方法，对14种氨基糖苷类抗生素药物进行测试， LOD、RT、线性范围和相关系数等结果见表3，部分化合物标准曲线图见图3。 表3.14种氨基糖苷类抗生素化合物LOD， RT，线性范围、相关系数及线性方程 Compound Name RT/min linear range LOD Curve Equation Tetracycline hydrochloride 潮霉素 2.5 5-500ppb 2ppb Y=8.162e1X+1.375e2； R^2： 0.9961；W： 1/X： Area Kanamycin 卡那霉素 3.9 5-500ppb 1ppb Y=1.633e3X-1.094e3； R^2： 0.9918； W： 1/X； Area Streptomycin 链霉素 3.9 20-500ppb 10ppb Y=1.386e1X-1.063e2；R^2： 0.9926； W： 1/X； Area Spectinomycin 大观霉素 5.4 10-500ppb 2ppb Y=8.78e1X+1.023e3： R^2： 0.9962：W： 1/X： Area Apramycin 安普霉素 8.8 5-500ppb 1ppb Y=1.86e2X+1.395e2： R^2： 0.9985： W： 1/X： Area Neomycin Sulfate 新霉素 12 5-200ppb 1ppb Y=2.204e2X+2.805e2： R^2： 0.9959：W： 1/X： Area Paromomycin Sulfate 巴龙霉素 12 10-200ppb 2ppb Y=1.605e2X-9.405e1；R^2： 0.9957；W： 1/X： Area Sisomicin 西索米星 12 1-200ppb 0.5ppbY=1.635e4X+2.145e3； R^2：0.9972；W： 1/X； Area Gentamicin 庆大霉素 15 5-500ppb 2ppb Y=6.959e1X+1.692e2：R^2： 0.9942W： 1/X： Area Amikacin 阿米卡星/丁胺卡 3.1 10-500ppb 5ppb Y=8.666e1X-6.675e1； R^2：0.9929；W： 1/X； Area 那霉素 Netilmicin 奈替米星 14 5-500ppb 2ppb Y=2.66e2X+5.723e2；R^2： 0.9984； W： 1/X； Area Dihydrostreptomycin 双氢链霉素 5.5 5-500ppb 2ppb Y=1.453e2X+3.03e2： R^2：0.9940； W： 1/X：Area Tobramycin 妥布霉素 9.6 2-500ppb 0.5ppb Y=3.258e2X+2.346e2； R^2： 0.9983； W： 1/X； Area Etimicin 依替米星 15 5-500ppb 0.5ppb Y=1.466e2X+6.768e2； R^2： 0.9949；W：1/X； Area SQLMS 图3.部分氨基糖苷类抗生素化合物标准曲线图 3.色谱图 采用上述仪器分析方法对14种氨基糖苷类抗生素化合物进行检测， 浓度为 50 ppb， 各化合物的提取离子流图见图4 图4：14种氨基糖苷类抗生素化合物提取离子流图 4.稳定性测试 采用上述仪器分析方法对浓度为 50 ppb的14种氨基糖苷类抗生素进行稳定性测试(n=6)， RSD%均<11%，LOQ连续6针的RSD%均<14%，其中庆大霉素50ppb时连续6针RSD%为5.39%，其在LOQ的浓度水平连续6针的RSD%为 13.96%(见图5)。14种氨基糖苷类抗生素在50ppb和LOQ浓度水平连续6针RSD%测式结果见表4，结果表明稳定性良好。 图5庆大霉素提取离子流图(n=6，c=10ppb) 表4.14种氨基糖苷类抗生素化合物50ppb和LOQ连续6针的RSD% Compound Name RT/min Res- RSD%/ LOQ/ RSD%/ ponse/ 50ppb ppb LOQ，N=6 50ppb Tetracycline 潮霉素 2.5 4405 3.3 5 9.93 hydrochloride Kanamycin 卡那霉素 3.9 91222 10.94 5 11.34 Streptomycin 链霉素 3.92 609 8.52 20 13.01 Spectinomycin 大观霉素 5.43 5022 5.12 10 5.3 Apramycin 安普霉素 8.82 10052 3.27 5 7.7 Neomycin 新霉素 12.22 11067 1.85 5 8.16 Sulfate Paromomycin 巴龙霉素 12.23 7813 4.28 10 7.7 Sulfate Sisomicin 西索米星 12.07 8390343.6 1 2.53 Gentamicin 庆大霉素 14.69 4076 5.39 5 13.96 Amikacin 阿米卡星/ 3.12 4211 8.69 10 13.8 丁胺卡那 霉素 Netilmicin 奈替米星 14.2 13584 2.88 5 6 Dihydrostrep- 双氢链霉素5.52 7437 6.01 5 7.7 tomycin Tobramycin 妥布霉素 9.61 16843 2.56 2 5.27 Etimicin 依替米星 14.65 8514 6.46 5 7.97 结论 本文基于LC-MS/MS结合离子色谱专利的电解再生膜抑制器技术平台建立了14种氨基糖苷类抗生素的检测方法。由实验结果可以看出，在此平台上建立的检测方法具有优异的灵敏度、稳定性和线性范围，可用于氨基糖苷类抗生素药的常规分析检测。 ( 参考文献 ) ( [1] McGlinchey T A ， Raf t er P A ， R eg a n F， et a l . 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