基因组制备技术

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  • 约稿|单细胞基因组测序技术及其在生物医学领域的应用
    人体组织器官由具有不同细胞类型的异质细胞群组成。传统批量测序(Bulk Sequencing)方法仅能捕获器官与组织群体细胞成分的平均水平,或者只代表其中占优势数量的细胞信息,单个细胞独有的特性常常被忽略。近年来,随着单细胞测序(Single-cell sequencing)技术的发展,实现了单个细胞水平上DNA或RNA的测序,从而能够特异和精准地探索单个细胞的基因变异水平,弥补了传统批量测序的不足[1]。图1. 单细胞测序与传统批量测序比较[1]单细胞基因组测序技术,是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项技术,广泛应用于癌症研究、胚胎发育、辅助生殖、细胞分化、免疫机制、微生物等生物医学方向的研究。本期主要对单细胞基因组测序的技术原理、技术流程、技术平台及其在生物医学领域的应用实例做简单介绍。技术原理单细胞基因组测序的原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序,揭示细胞间异质性的基因信息。技术流程单细胞基因组测序主要包括四个步骤,即单细胞分离→全基因组扩增→高通量测序→数据分析。目前单细胞基因组测序技术的发展依然面临两方面的技术挑战:一是易于分离和操作的单细胞分离工具(即第一步);二是能够稳定复制单个细胞中微小核酸的方法(即第二步)[2]。2.1 单细胞分离从组织中将单个细胞分离出来是单细胞基因组测序的第一步。目前常用的单细胞分离方法主要有:有限稀释法、显微操作法、流式细胞分选术、激光捕获显微切割技术(LCM)、微流控芯片技术等,表1总结了上述提到的单细胞分离方法的原理和优缺点,在使用时可根据不同的科研需求及样品情况综合考虑选择适宜的分离方法[3,4]。表1. 单细胞分离技术分离方法原理优点缺点有限稀释法对细胞进行一系列的倍比稀释,最终使细胞处于单个状态,理论上每μL约1个细胞,然后用移液器吸取相应容积的细胞悬液进行单细胞分离。操作简便;成本低,一般不需要特殊的设备。分离效率低;需要研究人员排除大量空白孔和多细胞孔,费时费力;细胞分离过程依赖梯度计算,容易出现错误。显微操作法在高倍倒置显微镜下,利用显微镜操作器(手动或自动)实现单细胞分离。能够准确地控制单细胞的吸取与释放;可以从不同的发育阶段或多样化的群体分离单个细胞。通量低,需要大量的起始量;细胞特异性由显微镜决定,并利用微量移液管分离,可能不够准确。流式细胞分选术通过流式细胞仪,根据细胞特异性分子标志物或细胞光散射特性,分选出单个细胞或特殊细胞群,实现单细胞分离。通量高;基于细胞表面标志物的特异标记,能够确保特定细胞的分离;利用荧光标记可分离亚群。无法扩展到大规模项目;且需要流式细胞仪,设备昂贵。激光捕获显微切割技术(LCM)在显微镜下,从冰冻/石蜡包埋组织切片(或细胞固定在装配有可以激光脉冲激活的热塑膜的涂片)中分离某一类型细胞群或单个细胞,实现单细胞分离。无需解离组织,制备细胞悬液;能够直观准确、快速地获取单个细胞或单一细胞亚群;能够保留所分离细胞的完整性。需要适当的组织处理(冷冻保存或固定);显微切割可能存在挑战;小的细胞可能难以分离;可能存在污染。微流控芯片技术通过微流控芯片隔离流动通道中的单个细胞从而达到单细胞分离的目的。通量高;上样体积小;周期短;可根据细胞表面标志物分离特定细胞。细胞大小必须均匀;消耗品昂贵。2.2 全基因组扩增(Whole-Genome Amplification , WGA)全基因组扩增是单细胞基因组测序的第二步。由于单个哺乳动物细胞中DNA的含量一般少于10pg,达不到测序仪的检测要求,因此在测序之前必须进行全基因组扩增(WGA)以获得足够的材料用于后续的文库制备。目前常用的全基因组扩增方法按原理可分为三类(见表2)[5-7]:基于聚合酶链式反应(PCR)的WGA方法{主要是简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)}、多重链置换扩增法(Multiple Displacement Amplification , MDA)和多重退火环状循环扩增技术(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles,MALBAC)等。表2. 全基因组扩增技术DOP-PCRMDAMALBAC原理基于PCR技术,通过加入部分简并的寡核苷酸引物与模板结合来实现扩增整个基因组的目的。基于恒温核酸扩增技术,恒温条件下,使用一条由6个随机碱基构成的随机引物与模板随机退火;紧接着在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应,并最终完成扩增。结合了MDA法和PCR扩增法的特点,即由一组随机引物启动扩增(每个引物具有通用引物序列和随机碱基),随机引物与模板均匀杂交,随后在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应,最终完成扩增示意图特点该方法实现了高度均匀的扩增,产物产量较高,操作较为简单;但仅产生基因组的稀疏覆盖,实验的条件需要较多优化。 MDA可以实现更好的基因组覆盖,产物片段长;但对模板质量要求高,可能产生非特异性产物。一种实现基因组广泛覆盖和均匀扩增的技术,灵敏度高,产物产量高。技术平台:目前,国内外研究机构使用的大规模单细胞测序技术平台主要有五种:Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution、BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System、10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution、ICELL8 Single-Cell System和C1™ 单细胞全自动制备系统。国内也有多家企业进军单细胞测序领域,产品包括新格元自动化单细胞处理系统、万乘基因高通量单细胞测序平台、达普生物星海单细胞测序建库系统、墨卓生物高通量单细胞测序平台、德运康瑞痕量单细胞测序平台和原位测序平台等。各个平台各有特点,这里主要简单介绍一下两种应用较多的技术,即10X Genomics 公司的Chromium( 液滴法) 及 BD 公司的Rhapsody( 微孔法)。10x Genomics单细胞测序技术:10X Genomics单细胞测序起源自Drop-Seq技术,应用液滴微流体技术分选单细胞,将单个细胞与含有条形码(Barcode)和引物的凝胶珠一起包裹于油滴中;然后每个油滴中的凝胶珠溶解, 细胞裂解释放mRNA,通过反逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA,cDNA在液体油层破坏后进行文库构建,使用测序平台对文库进行测序检测,即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据。该平台具有“三高(high)两低(low)”的特点:即通量高,细胞捕获效率高,细胞活性要求高(大于90%),分析时长低,成本低。 图2. 10X Genomics Chromium Controller技术原理示意图3.2 BD Rhapsody单细胞测序技术:BD公司推出的这款Rhapsod™单细胞分析系统采用了Cytoseq分子标签技术,能为单细胞中每个转录本标记特异性分子标签,实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量。同时,将每个细胞标记上特异性细胞标签,实现了高通量平行建库。该技术在基因扩增和后续的测序部分等整体流程与10x Genomics单细胞测序技术相近,主要区别在于起始的单细胞分离和捕获技术。该技术并非基于微流控芯片技术,而是基于蜂巢板技术,基于微孔来保证单细胞的捕获,避免了10x Genomics单细胞测序技术中存在的概率碰撞对捕获效率从影响。细胞悬液经注入孔注入后,自然沉降到反应孔中,随后, 将磁珠同样由注入孔注入,即可在单个反应孔中捕获其中的细胞。微孔和纳米孔方法允许稀释的细胞悬浮液在每孔一个珠子和一个细胞的条件下与寡聚结合珠一起沉降到皮升大小的孔中,从而保证了单孔中是单细胞捕获。 图3. BD Rhapsody技术原理示意图4、应用实例:目前,单细胞基因组测序技术的应用可以归纳为两大类,即应用于人类细胞图谱研究和非细胞图谱研究。单细胞基因组学的优势就在于能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态,反映细胞间的异质性。自2017年“人类细胞图谱计划”提出以来,单细胞测序技术已陆续揭示了多个组织器官的单细胞图谱,如通过对肾脏肿瘤进行单细胞测序,发现肾肿瘤细胞之间的突变频率和位置不尽相同,每个细胞的突变状态和转录情况也均不相同,表明肾肿瘤更加具有异质性,需要开发更加有效的细胞靶向疗法。2022年发表在Nature杂志上的研究,对人脑血管系统的单细胞图谱进行了分析,描绘出海马和皮质的脑血管细胞组成:内皮细胞、相邻的壁平滑肌细胞 (SMC) 和周细胞、血管周围的免疫细胞和星形胶质细胞等,这些细胞在大脑不同区域存在差异并沿动静脉轴变化,沿动静脉轴的细胞组成异质性产生了大脑健康所必需的功能分段的循环、代谢和渗透特性。揭示了人类大脑血管系统的细胞组成和分子特征,提示了阿尔茨海默病(AD)风险因素在人类中的进化转变,有助于对人类大脑健康基础的了解、疾病机制和治疗靶点的发现[8]。随着单细胞基因组覆盖范围扩大、通量提升以及多组学技术的不断进步,单细胞基因组学技术将为丰富发育谱系树、生殖细胞突变模式、癌症进化、基因组功能和微生物群落的分辨研究等提供策略[9]。参考文献:[1] Xia Y, Gawad C. Bringing precision oncology to cellular resolution with single-cell genomics[J]. Clinical and experimental metastasis, 2022(1):39.[2] Liang J, Cai W, Sun Z. Single-cell sequencing technologies: current and future. J Genet Genomics. 2014 Oct 20 41(10):513-28. doi: 10.1016/j.jgg.2014.09.005. Epub 2014 Oct 18. PMID: 25438696.[3] Wang Y, Navin N. Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):598-609.[4] Gross A, Schoendube J, Zimmermann S, Steeb M, Zengerle R, Koltay P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 2015 Jul 24 16(8):16897-919. [5] Gawad C, Koh W , Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the science[J]. Nature Reviews Genetics, 2016.[6] Grün D, van Oudenaarden A. Design and Analysis of Single-Cell Sequencing Experiments. Cell. 2015 Nov 5 163(4):799-810.[7] 徐晓丽 吴凌娟.单细胞全基因组扩增技术与应用.[J]生物化学与生物物理进展 .2019.46(4)[8] Yang A C , Vest R T , Kern F , et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk[J]. Nature, 2022, 603.[9] Evrony G D, Hinch A G, Luo C. Applications of Single-Cell DNA Sequencing[J]. AnnualReview of Genomics and Human Genetics, 2021, 22(1).相关会议推荐:第六届基因测序网络会议来袭!六大会场,含单细胞和空间组学会场,点击下图免费报名!点击链接进入会议官网:https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/geneseq2023/
  • 2015技术展望之基因组编辑
    规律成簇的间隔短回文重复CRISPR与内切酶Cas9的组合,原本是细菌抵御病毒的重要武器,现在这一组合已经成为了最热门的基因组编辑利器。   2014年基因组编辑热潮在持续发酵,CRISPR/Cas9仍旧是最引人注目的话题之一,相关论文被大量下载和引用。纵观CRISPR/Cas9的发展我们可以看到,科学家们仍在追求最理想的基因组工程技术,而2015很有可能会成为基因组工程年。   这里我们不妨大胆预测一下,明年基因组工程领域会起那些波澜:   1. 大规模CRISPR/Cas9。2013年,麻省理工的CRISPR技术先驱张锋(Feng Zhang)和同事为我们展示了CRISPR/Cas9进行多重基因组编辑的能力。相信在2015年大规模CRISPR/Cas9全基因组操作将越来越多,同时新多重基因组编辑法会大量涌现,还很可能会出现大型的引导RNA数据库。在这样的趋势下,每个人都能在自己的基因组工程研究中用上CRISPR/Cas9。   2. CRISPR对簿公堂。2015年将有更多公司提供以CRISPR为基础的实验工具,基于CRISPR的药物也将离我们越来越近。在这种情况下,基础研究领域可能会迎来历史上最大的专利诉讼。目前有三个团队都宣称自己享有CRISPR/Cas9技术的部分专利权,他们很可能最终会对簿公堂,而专利权的归属将决定CRISPR/Cas9日后的命运。   3.用细胞来记录生命。假如细胞能将自己发生的所有事情记录下来,我们将会读到些什么呢?2014年Timothy K. Lu和Fahim Farzadfard在Science杂志上发表了一项令人振奋的成果。他们通过合成生物学技术,将细胞事件的模拟记忆编码在活细胞DNA中。虽然这类研究还处于早期阶段,但随着研究者们不断突破细胞工程的极限,我们期待在2015年看到更多的进展和应用。   当然了以上都只是我们的推测,基因组工程领域其实是很难预测的,因为相关技术发展得非常之快。你看,短短两三年CRISPR/Cas9系统就走了这么远。这些基因工程领域的预测是否过于保守,就让我们拭目以待吧。
  • 药典委公示微生物全基因组测序技术指导原则标准草案
    11月29日,国家药典委员会官方网站公示了关于微生物全基因组测序技术指导原则标准草案,公示时间为3个月。详情如下:编号:Fg2022-0216号我委拟制定微生物全基因组测序技术指导原则,为确保标准的科学性、合理性和适用性,现将拟制定标准公示征求社会各界意见(详见附件)。公示期自发布之日起3个月。请认真研核,若有异议,请及时来函提交反馈意见,并附相关说明、实验数据和联系方式。相关单位来函需加盖公章,个人来函需本人签名,同时将电子版发送至指定邮箱。联系人:朱冉、陈蕾电话:010-67079581 010-67079566电子邮箱:zhuran@chp.org.cn通信地址:北京市东城区法华南里11号楼 国家药典委员会办公室邮编:100061国家药典委员会2022年11月29日附件:微生物全基因组测序技术指导原则公示稿.pdf微生物全基因组测序技术指导原则起草说明.pdf微生物全基因组测序技术指导原则 本指导原则对全基因组测序技术用于药品微生物控制给予通用性技术规定,为药用原料、辅料、制药用水、中间产品、终产品、包装材料、环境、设备和人员等药品全生命周期质量控制中微生物精准鉴定、溯源分析和风险识别等提供指导。微生物全基因组测序(Microbial whole-genome sequencing)是指利用高通量测序技术对微生物个体的整个基因组序列进行测定,获取遗传信息的过程。高通量测序技术主要包括:边合成边测序、半导体测序、DNA (Deoxyribonucleic acid, DNA)纳米球测序、连接酶测序等第二代测序技术(又称下一代测序,Next Generation Sequencing)和基于单分子测序(Single Molecule Sequencing)的第三代测序技术。第二代测序技术的基本原理主要是利用物理或酶切的方法将待测样本的基因组打断到1kb以内的DNA片段,在其两端连接特定接头序列后,固定于测序介质中,通过核酸扩增技术,如聚合酶链式反应、等温扩增技术等将待测样本放大收集成库,然后进行平行循环测序。当需要获得微生物样本基因组精细图、完成图时,可采用能够实现大片段测序读长的第三代测序技术。第三代测序技术的基本原理主要有:采用荧光标记脱氧核糖核苷酸,用光学镜头实时记录DNA合成过程中新引入脱氧核糖核苷酸的荧光变化,通过不断地重复合成、成像、淬灭等过程进行单分子荧光测序;或采用电泳技术驱动单个分子逐一通过纳米孔,通过检测不同碱基的电信号,进行单分子纳米孔测序。本指导原则以目前发展成熟、应用较为广泛的第二代测序技术为主要技术手段,对实验室的一般要求、全基因组测序的主要技术指标、技术流程、影响测序结果的主要因素、方法学考察和应用指导等方面进行通用性技术规定。一、实验室的一般要求1.实验场地及人员 开展微生物全基因组测序的实验环境应具备分子生物学实验室的基本条件,并符合相应级别的生物安全等级要求。实验区域一般应设置:试剂储存和准备区、样本制备区、扩增区、核酸测序及分析区,各个区域在物理空间上相互独立,并标识明确;另外,根据使用仪器的功能,相关区域可适当合并。应单向流进入各工作区域,按照试剂储存和准备区、样本制备区、扩增区、核酸测序及分析区的先后顺序进行实验操作。实验区域应定期进行清洁消毒。实验人员应具备分子生物学和微生物学专业背景,或经专业培训。2. 实验仪器实验室一般应具备高通量核酸测序仪、核酸扩增仪、片段分析仪、核酸定量仪、生物安全柜、混匀器、高速离心机、水浴或加热模块、冰箱、微量加样器等分子生物学检验常用仪器设备。影响测序质量的仪器设备应定期进行性能确认和维护,以保证仪器处于良好的运行状态。3. 实验试剂除另有规定外,所有实验使用的试剂均应不含DNA和DNA降解酶,宜大体积配制、小体积分装,并保证试剂的无菌性,必要时可采用高压灭菌或0.22 μm孔径滤膜过滤除菌。用于核酸扩增的相关试剂应避免反复冻融。关键试剂应制定质量控制程序,以确保试剂质量。采用适宜的商品化试剂或试剂盒进行核酸提取、文库构建和核酸测序时,应按照说明书操作,并符合说明书中的质量控制要求。二、全基因组测序的主要技术指标1. 测序通量测序通量是指单次测序可获得序列信息的基因片段数量或可测定的DNA (以碱基表示)数量。核酸测序仪器的测序通量直接关系到测序输出的数据量。微生物的基因组DNA较小,但不同种属之间变化幅度较大,如:葡萄球菌属、埃希菌属、假单胞菌属、沙门菌属等常见细菌的基因组DNA大小约3~6 Mbp;酵母菌的基因组DNA大小约12~16 Mbp;典型致病霉菌的基因组DNA通常大于30 Mbp。在进行微生物全基因组测序时,应根据待测样本基因组大小、样本数量等实际需求,选择适宜测序通量的测序仪器和配套试剂,保证测序结果的准确性。2. 碱基识别质量碱基识别质量是衡量碱基正确识别的概率(通常以数字值直接表示)。碱基识别质量与碱基识别错误率之间的关系为:Q=-10lg P(Q为碱基识别质量,P为碱基识别错误率)。Q=20代表碱基识别正确率≥99%;Q=30代表碱基识别正确率≥99.9%。高通量测序仪器应能自动判读碱基识别质量。三、 技术流程 全基因组测序的一般流程包括:测序样本的获得、测序文库的构建、全基因组测序和数据分析等。1. 测序样本的获得 全基因组测序主要用于待测微生物的核酸序列测定。待测微生物应进行分离纯化,以获得生长状态稳定的纯培养物,可参考“微生物鉴定指导原则”(通则9204)。分离纯化后的纯培养物应采用适宜的方法,可参考“细菌DNA 特征序列鉴定法”(通则1021),获得浓度、纯度和完整性良好的基因组测序样本。2. 测序文库的构建 测序文库是指将基因组样本随机打断后,在其两端加入特定接头序列(adapters),并经过大规模平行扩增,形成的DNA片段集合。测序文库中样本的核酸浓度、纯度、片段的大小分布等因素,都会影响测序输出的数据量和碱基识别质量。应对构建的测序文库进行纯化、定量、均一化处理,使文库中各待测样本的浓度保持均等;必要时,采用凝胶电泳或毛细管电泳等方法检测文库的质量。3. 全基因组测序 将测序文库中的待测样本固定在测序介质中,通过特定接头序列,将测序引物与待测核酸序列进行结合。加入底物脱氧核糖核苷酸,在DNA聚合酶作用下,使结合在待测核酸序列上的测序引物进行延伸,并利用信号收集器采集信号,包括但不限于光信号、电信号或离子信号等,通过信号分析软件对采集到的信号进行分析,获得待测样本的碱基序列信息,以及物理通量、有效通量、测序读长、测序深度、碱基识别质量等参数。4. 数据分析 采用适宜的序列分析方法和软件,对得到的核酸测序下机数据进行序列拼接,最终获得待测微生物样本的全基因组序列信息。四、 影响测序结果的主要因素 1. 待测样本核酸质量 应采用适宜的方法提取待测样本的基因组DNA,并保证提取的基因组DNA 在适宜的浓度和纯度范围内,无蛋白、多糖等污染。一般情况下,核酸浓度宜不低于10 ng/μl,A260/A280比值宜在1.8~2.0之间。核酸浓度较低,或发生降解等导致质量不佳的情况,可导致基因组DNA片段化不完全,影响文库质量,进而影响测序深度和测序结果。2. 测序文库质量 应对测序文库进行质量控制。当测序文库中包含多个待测样本时,不同样本的核酸浓度应基本一致,保证测序后的输出数据量均匀稳定。推荐采用荧光分析法定量检测不同样本的基因组DNA浓度,测序文库制备完成后,采用适宜的稀释倍数,确定上机测序文库的浓度。3. 测序深度 测序深度是指待测样本中某个指定核苷酸被检测的次数。一般高通量测序仪器输出的测序深度指待测样本基因组序列中核苷酸被检测次数的平均值。测序深度与基因组覆盖率之间是正相关,测序深度越大,重复测序次数越多,待测样本基因组覆盖率越大,测序带来的错误率也会随着测序深度的提高而降低。一般而言,基因组测序深度应不少于50倍;建立全基因组序列参考数据库时,测序深度应不少于100倍。4. 碱基识别质量 碱基识别质量是评价测序结果准确率的重要因素。根据核酸测序仪器的正常运行参数,单个样本的核酸测序的结果应保证Q20≥80%或Q30≥70%;也即测序数据中80%及以上的碱基正确率大于99%,或者70%及以上的碱基正确率大于99.9%。五、 方法学考察 除考察影响测序结果的主要因素,包括:待测样本核酸质量、测序文库质量、测序深度、碱基识别质量等,还应进行相应的分析方法学考察;可在测序过程中增加已知序列的参考品,评估测序仪器性能,以保证全基因组测序结果的准确性和重现性。六、 应用指导 微生物全基因组序列能够提供全面丰富的遗传信息,通过全基因组序列的比对分析,可以实现待测微生物,包括:标准菌株、模式菌株、质控菌株、生产检定用菌(毒)种、益生菌等,以及从药用原料、辅料、制药用水、中间产品、终产品、包装材料和环境等中检出污染微生物等的精准鉴定、溯源分析以及风险评估等。精准鉴定当基于常规生化筛选、表型和基因型鉴定方法无法获得待测微生物样本准确的鉴定信息时,可利用全基因组测序技术获得更加精准的鉴定结果或遗传变异信息等。全基因组序列分析还对研究微生物的系统进化具有重要价值,有助于新种或亚种的发现和遗传分类单元的系统发育解析,提高对新种或亚种的生物学认识。溯源分析当出现无菌试验结果阳性、培养基灌装等模拟工艺失败、生产过程严重异常事件时,如常规基因型鉴定方法无法提供足够的分辨力,可在获得菌种鉴定信息的基础上,采用全基因组测序技术对目标微生物以及相关环节中分离的同种微生物进行全基因组序列的同源性分析,结合污染调查信息,实现目标微生物的溯源分析风险评估全基因组序列包含了微生物菌株全部的遗传信息,基于全基因组数据分析还能够用于毒力、耐药以及其他基因的功能分析与表型预测,为开展微生物的风险评估分析提供参考依据。起草单位:上海市食品药品检验研究院联系电话:1800677839复核单位:中国食品药品检定研究院、天津市药品检定研究院、辽宁省药品检验检测院参与单位:浙江现代生物技术发展中心、中国工业微生物菌种保藏中心

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  • 英开发出简化的基因组测序新方法

    无需进行文库制备,所用DNA样本比标准方法更少2012年12月13日 来源: 中国科技网 作者: 陈丹 中国科技网讯 据物理学家组织网12月12日(北京时间)报道,英国研究人员简化了基因组测序的标准流程,首次无需进行文库制备便完成了DNA(脱氧核糖核酸)单分子测序,而且新方法只要很少量的DNA就能获得序列数据,用量可低至不到1纳克(10亿分之一克),仅为常规测序方法的500分之一到600分之一。 文库制备是指从测序前基因组样本中提取不同长度的DNA片段,这一过程不仅费力、费时,还会浪费DNA,而新技术能极大地减少DNA的损耗,并缩短测序时间。 该研究论文的第一作者、英国威康信托基金会桑格研究所的保罗·库普兰说:“我们用这种方法对病毒和细菌的基因组测序后发现,即使在相对较低的水平,我们也能够确定所检测的是何种有机物,不论样本中是否存在特定的基因或质粒(这对于确定抗生素耐药性很重要),或者其他信息,如对特定DNA碱基的修改等。”他表示,一旦技术得到优化,将在快速、高效地识别医院和其他医疗场所中的细菌和病毒方面具有很大的应用潜力。 研究小组利用第三代单分子测序系统PacBio RS演示了这种简化的直接测序方法。他们仅仅用800皮克(千分之一纳克)DNA来分析一个生物体的基因组,尽管测序仪只读取了基因组的70个序列片段,相对于常规测序方法获得的数据来说不过是很小的一部分,但这些信息足以让研究人员确定他们所检测的生物体的品种。 这项技术也使得科学家能够对此前无法识别的宏基因组(也称微生物环境基因组)样本中的生物体进行确认。“为微生物测序,首先需要能够在实验室中培养它们。”论文的主要作者、英国巴布拉汉研究所的塔米尔·钱德拉说,“这不仅耗费时间,而且有时候微生物不生长,为它们的基因组测序极其困难。”他表示,新方法可以直接对微生物测序,短时间内便可确定其“身份”。 论文的另一主要作者、威康信托基金会桑格研究所的哈罗德·斯维尔德洛说:“我们的技术可以在对所测序列没有任何先验知识、没有特定微生物试剂的条件下,在很短的时间内操作,这是一种很有前途的替代手段,可应用于控制感染等临床需要。”(记者陈丹) 总编辑圈点 长久以来,基因测序等围绕基因科学所展开的研究,都被人们贴上了从本源上解开人体生命奥秘、彻底解除遗传疾病威胁等殷切的标签。多国为提高社会健康水平,都开展了解码国民DNA的活动,有些甚至覆盖全基因组。然而,面对由30亿个碱基对构成的人类基因组,精确测序注定将是一场浩大而又漫长的工程。如何能快速、准确地将海量DNA数据转化为有帮助的实用信息,已经成为该领域科学家们面临的重大挑战之一。因而我们说,英国科学家此番取得的突破,不管是从整个学科研究的方法论层面,还是从临床应用的角度,都提高了基因研究服务于人类的速度。 《科技日报》(2012-12-13 一版)

  • 最新测序技术能用单个细胞分析基因组

    最近,来自美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校、克雷格·文特尔研究院和Illumina公司的科学家对现代基因测序算法进行了改良,只需从一个细菌细胞中提取的DNA(脱氧核糖核酸)就可组装成接近完整的基因组,准确率达到90%,而传统的测序方法至少需要10亿个相同的细胞才能完成。这一突破为那些无法培养的细菌提供了测序方法。研究发表在9月18日的《自然·生物技术》网络版上。  实验室无法培养的细菌范围极广,约占99.9%,从产生抗体和生物燃料的微生物,到人体内的寄生菌。它们的生存条件特殊,比如必须和其他菌种共生,或只能生存在动物皮肤上,因此很难进行人工培养。  论文合著者、文特尔研究院的罗杰·拉斯肯教授10年前曾开发出一种多重置换扩增(MDA)技术,可对实验室无法培养的细菌测序,能恢复70%的基因。其工作原理是对一个细胞的基因片断多次复制,直到其数量相当于10亿个细胞那么多。不过,这种技术却给测序软件带来很多麻烦,它在复制DNA时会出现各种错误,而且并非完全统一放大,有些基因组被复制数千次,有一些却只被复制一两次。但测序算法不能处理这些不一致,而是倾向于舍弃那些只复制了少数次的基因,即使它们对整个基因组来说很关键。  加州大学圣地亚哥分校雅各布工程学院计算机科学教授、现代基因测序技术算法创建人帕维尔·帕夫纳和同事改进了这一方法,保留了那些少量复制的基因片断,并用新方法对一个大肠杆菌测序以检验其精确性,发现它能恢复91%的基因,接近传统的培养细胞水平。这已足够解答许多重要的生物学问题,比如该细菌能产生什么抗体。  人体细菌占体重的约10%,它们有些会造成传染病,但也有的能帮助消化,最近研究还发现,它们能改变人的行为方式,比如引诱人吃更多的东西。新方法也有助于科学家理解细菌行为,研究人体内细菌能产生哪种蛋白质和多肽,这些蛋白质和多肽是细菌之间、细菌和宿主之间互相沟通的工具。  研究小组还用新方法对一种以前未曾测序过的海洋细菌进行了测序,获得了相当完整而且能解释的基因组,掌握了它是如何生存和运动的,该基因组将被存入美国国家卫生研究院的基因银行(GenBank)。研究人员表示还将对更多迄今未知的细菌进行测序。

  • 【讨论】基因组越大越容易研究基因的调控机制么?

    霍华休斯医学研究所,Baylor医学研究所的科学家们近期在PloS One上发表最新研究性文章,文章标题为:Big Genomes Facilitate the Comparative Identification of Regulatory Elements,该文章解析了基因组大小对基因组学的研究带来的影响。基因组越大则更容易找出控制基因活性的DNA区域。在小基因组上,功能性元件紧紧地结合在一起。而在大基因组上,功能性元件分得比较散,于是也更容易找到控制基因活性的区域。 基因组分为结构基因和调控基因,要从基因组上找到功能元件并不难,难的是找到调控基因表达的机制,因此,对小的基因组来说,紧凑的结构给寻找调控区域带领更多的困难,而相对来说大基因组却容易多了。功能元件散落在基因组上,更便于寻找调控区域。大的基因组更便于研究非编码DNA和RNA,对研究基因调控也更为有利。而目前,研究生命的遗传物质DNA的科学家一直觉得,基因组越小越受欢迎,因为操作简单,可以节省大量的时间和精力,尤其在金钱方面也能更节约成本,测序的费用更低。甚至有科学家说,基因组小则基因排列更紧凑,垃圾DNA也越少。 [img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=137848]Big Genomes Facilitate the Comparative Identification of Regulatory Elements[/url]

基因组制备技术相关的资料

基因组制备技术相关的仪器

  • PrepChromaster-8000型高压制备色谱系统-----专为高通量纯化打造 为了满足中药与天然产物分离纯化领域的需求,推出了PrepChromaster品牌,为该领域提供制备色谱解决方案级产品,是中药与天然产物分离纯化实验室的理想选择。PrepChromaster-8000型是一款连接快速色谱和传统高压制备高效液相色谱的二元制备色谱设备,主要应用于药物活性成分、天然产物研究,合成化学分离纯化,在节省制备成本的同时极大地提高了分离效率。仪器特点1、本系统最大制备量可达克级,可适配10-100mm直径的各类色谱柱;2、本系统检测器使用全波长紫外-可见检测器,可同时选用4个不同检测波长3、本系统可使用Flash柱,支持各种级别的Flash低压分离纯化;4、本系统可以使用高压不锈钢柱,支持300bar以内高压级别的分离;5、本系统支持液体或固体样品上样,可以避免贮备过多的定量环;6、具有压力显示、报警、过压保护功能,实时监控泵的压力波动;7、本系统具有全波长光谱扫描功能,可检测190nm-850nm范围任意四个波长信号;8、带有光源自检功能,管理光源寿命,提醒及时更换;9、带有单色仪自校正功能,波长准确性高;10、进样方式独特设计,防止样品与溶剂扩散;11、本系统采用先进的进样技术,两种进样模式可选,进样时间短,避免样品残留和堵塞;12、高速准确的阀切换,避免样品的损失,提高回收率。13、本系统可以使用小粒度填料的不锈钢柱和商品化的Flash柱;14、独立的进样和馏分收集流路,避免交叉污染;15、智能馏分收集器可按体积、阈值、时间和色谱峰收集馏分;16、本系统提供多种标准试管架和试管,用户可自定义试管架,标配孔径18mm试管架;17、软件具有自动进样、梯度、色谱图、馏分收集图、设备状态同图显示的功能;18、软件具有自动进样状态显示与控制功能,可显示阀、注射泵、进样臂的状态;19、软件支持梯度,程序设定功能,具有阶梯、线性、点-拖式梯度曲线;20、软件支持智能馏分收集,具有时间、阈值、峰值、手动等多种收集方式;21、软件支持馏分索引功能,实时显示馏分收集位置与对应的色谱峰位置;22、软件支持色谱分峰与定量功能、审计追踪、数据管理、用户管理、个人管理等功能;23、仪器操作有软件控制,分离纯化参数都可以在线更改;24、软件中文界面,模块化设计,便于学习和操作,符合中国用户使用习惯。 仪器组成1、高压二元梯度泵系统;2、混合器;3、四波长UV-VIS检测器;4、自动进样器馏分收集一体机;5、溶剂槽;6、模块化液相工作站;7、电脑 ; 技术指标泵1、流量范围:0~200mL/min单泵,0~400mL/min双泵;2、压力范围:标准300bar;紫外检测器1、检测器范围:190~850nm;2、检测器光源:氘灯-钨灯组合光源;3、波长精度:±1nm;重复性0.2nm;4、检测方式:UV-VIS检测器,4波长实时显示;自动进样模块1、定量环:10mL;2、进样位数:108位;3、试管规格:13*100mm;馏分收集模块1、馏分收集容器:400位(标配);2、试管规格:18*180mm,(其它规格可定制); 可选配件1、 蒸发光散射检测器;2、二极管阵列检测器; 由于技术不断进步,本公司保留设计更改之权利,更改恕不通知,敬请谅解。
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  • Magnis 系统为 NGS 文库制备提供了一套完整的自动化解决方案,可为您提供可重现的结果,能够轻松分析基因组 DNA 中的多个基因和复杂的基因突变,适用于福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织等降解样品。这款台式仪器能够自检和调校;提供预先分装的试剂;并附带预设程序。无需过多专业知识即可运行该系统。机载向导能够在五分钟内完成分析设置。此外,Magnis?可自动检查条形码,提示用户试剂的正确位置。按下?开始?按钮后,用户即可离开仪器,通过向导和 LED 状态指示灯直观检查分析进度。?
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  • 单细胞RNA测序使研究人员能够通过区分异质群体中的不同细胞个体,更加深入的了解细胞功能、疾病进展和治疗效果。illumina Bio-Rad单细胞测序方案由测序技术和微滴数字PCR技术两大各自行业的领军公司共同开发,可在单次实验中对数百个至数万个细胞的转录组进行分析,并为研究人员提供强大的、可拓展性的、用户友好的工作流程。完善的单细胞测序解决方案:从样本制备到数据分析SureCell WTA 3’文库制备试剂盒提供了单细胞测序所需的所有试剂,包括ddSEQ单细胞微滴制备系统所需的分离试剂、编码试剂以及文库构建所需要的Nextera试剂;而BaseSpace Sequence Hub分析平台提供简化的、一键式生物信心数据分析流程。1. 可拓展的、灵活的单细胞分析方案- 5min可完成4个样本的微滴制备- 每个样本可包裹数百至数千个单细胞,每日可处理数万个单细胞- 微滴数字化技术制备稳定、均一的微滴,确保高效的细胞裂解和RNA编码2. 简捷的文库制备流程- Nextera 技术简化建库流程,无需预扩增- 使用特异的标签序列(Index)标识24个样本的文库- 高灵敏的检测技术确保检测更多的基因3. 一体化的测序和数据分析方案- BaseSpace 单细胞分析APP,一键式数据分析- 可视化分析流程、轻松分享数据- 基于云端的数据存储和分析,安全无忧高质量数据1. RNA测序结果无细胞大小偏好HEK 293,NIH 3T3,A20和BJ细胞经由SureCell 3' WTA 文库制备试剂盒处理。A. TC20 自动细胞计数仪测量的细胞粒直径B. 每个细胞测得的基因数中值 2. 可靠的单细胞转录本鉴别物种混合实验中对HEK 293和NIH 3T3细胞进行分析。 3. 高灵敏度和重复性NextSeq 550上分析测序重复样本。
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基因组制备技术相关的耗材

  • 人类基因组芯片配件
    人类基因组芯片配件是全球第一个完全基于人类基因组顺序的基因芯片微阵列,这种基因芯片的设计和制造使用了完整注解的25 509组人类基因。 这种新一代人类基因组芯片配件相对于其它产品有重要优势,其它产品往往从来源源注释不清的基因数据库组成ESTs序列。 这 种ArrayIt人类基因组芯片H25K/BT是一种多用途微阵列,含有26304长的寡核苷酸,设计用来优化在一个单一的生化反应中的对整个人类基因组 的研究。用户可以利用从基因组DNA,mRNA和蛋白质中的样品。可以研究许多问题,从核型分析和基因表达分析,到以染色质结构和蛋白质-DNA相互作用 的问题都可以研究。基因表达的革命性的学说是,一个位点上基因的单个杂交反应中可以定量测量超过300 000个基因转录。研究人员可能在H25K/ BT芯片买到一个或多个寡核苷酸。 关于生物信息学,寡核苷酸生产的最先进的技术,芯片印刷和表面化学带来前所未有的特异性和敏感性,从而优化结果的分析和利用。 编号 名称 H25K:BT 人类整个基因组(25 509 基因 - 26 304 长寡核苷酸)
  • 人类基因组芯片
    人类基因组是全球第一个完全基于人类基因组顺序的基因芯片微阵列,这种基因芯片的设计和制造使用了完整注解的25 509组人类基因。 这种新一代人类基因组芯片相对于其它产品有重要优势,其它产品往往从来源源注释不清的基因数据库组成ESTs序列。 这 种ArrayIt人类基因组芯片H25K/BT是一种多用途微阵列,含有26304长的寡核苷酸,设计用来优化在一个单一的生化反应中的对整个人类基因组 的研究。用户可以利用从基因组DNA,mRNA和蛋白质中的样品。可以研究许多问题,从核型分析和基因表达分析,到以染色质结构和蛋白质-DNA相互作用 的问题都可以研究。基因表达的革命性的学说是,一个位点上基因的单个杂交反应中可以定量测量超过300 000个基因转录。研究人员可能在H25K/ BT芯片买到一个或多个寡核苷酸。 关于生物信息学,寡核苷酸生产的最先进的技术,芯片印刷和表面化学带来前所未有的特异性和敏感性,从而优化结果的分析和利用。 编号 名称 H25K:BT 人类整个基因组(25 509 基因 - 26 304 长寡核苷酸)
  • 比较基因组杂交CGH芯片微阵列
    比较基因组杂交CGH芯片微阵列是一种建立在发现基因组失衡和染色体畸变(异常从几百碱基到几兆碱基)基础上的技术。这种技术允许对基因组异常进行定量分析,分辨率比Constitutional 染色体组型高50?100倍。 Constitutional Chips4.0是在细胞遗传学领域的一个创新,用于分子诊断和研究的持续发展。该CGH芯片应用于许多领域和研究领域,如新生儿和产前诊断,肿瘤细胞和干细胞领域。 CGH芯片特色 Constitutional Chips4.0的一些特征 杂交前,DNA样本不需要放大。该芯片提供整个基因组的高分辨率视图,没有缺陷基因的预选,不像FISH(荧光原位杂交) 提供临床显著基因位点的全面覆盖。 不要求细胞培养,不像Constitutional核型分析的技术。 使用该技术,可以在2天内获得的结果。 编号 名称 4060-0010 Constitutional Chips 4.0 (10 芯片) 4040-0020 标签试剂(适合 10芯片) 4050-0010 杂交试剂 (10 芯片)

基因组制备技术相关的试剂

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