皮下注射模拟系统

目前大多数治疗性抗体都是以静脉注射的方式进行给药，由于其伴随着病人顺应性差以及高昂的医疗成本等现实问题，使得皮下注射制剂逐渐成为行业关注的热点。相比于静脉注射，皮下注射具有提高病人的依从性，降低医疗成本等优点，而典型的皮下注射需要控制注射体积(一般为1-2ml)，从而需要提高蛋白浓度，而高浓度蛋白伴随着蛋白粘度的急剧增加，是限制皮下注射制剂的重要原因。在现实工艺开发过程中往往面临着各种难点:高粘度蛋白溶液超过粘度注射限，带来可注射性挑战高浓度高粘度蛋白更容易发生聚集，引起蛋白稳定性挑战高粘度蛋白溶液引起TFF过滤步骤的通量、工艺效率、回收率降低等挑战默克高浓度蛋白粘度降低平台 通过发挥辅料组合协同效应，有效降低蛋白粘度，提高蛋白稳定性，实现高浓度制剂皮下注射。市售制剂配方粘度对蛋白浓度的依赖性图1. 市售制剂中抗体浓度与粘度的关系从图1可以看出，随着蛋白浓度的增加，蛋白可能发生分子间相互作用或者分子拥挤，从而引起蛋白粘度的急剧升高，一些蛋白产品在浓度刚刚达到100 mg/mL时，粘度已经很高，甚至超过了粘度注射限(一般皮下注射药液粘度不超过25mPas), 此时通过注射器给药变得十分困难。为了解决这一问题，我们研究了不同的辅料组合，通过加入这些辅料组合来有效降低蛋白粘度，以满足皮下注射的要求。材料与方法选择已经在FDA或EMA注册的单克隆抗体产品进行研究。在本研究中，我们选择pH7.2的抗TNF-α嵌合单克隆抗体(mAbC) 作为模型药物，考察不同的辅料及组合对其粘度的降低效果。其中所有辅料和缓冲试剂产品均购自德国默克公司。采用装有Ultracell-30k超滤膜的AmiconUltra-4超滤管进行缓冲液置换和蛋白浓缩。对于辅料研究，以2000 x g的离心力进行离心并置换了5个透析体积，同时用2000 x g离心力进行浓缩。根据Lambert-Beer定律并使用BioSpectrometer Kinetic (Eppendorf, Hamburg, Germany) 在280 nm处测量来确定蛋白浓度。用相应的缓冲液配制稀释液，使用同样的方法再次验证上述测得结果。粘度测试：将蛋白样品在20°C平衡后，用m-VROC™ 粘度计在1000 - 3000s-1的剪切速率下测量蛋白粘度。将200 μL的蛋白样品装入500 μL气密注射器中(Hamilton, Reno, USA)，重复测量3次。通过Dynapro PRIII (Wyatt Technology, Santa Barbara, USA)的动态光散射(DLS)测量粒子的扩散系数Dt，样品在25°C下采集10次，每次采集5秒。通过对mAb C在3 ~ 14 mg/mL的浓度范围内的扩散进行线性拟合，得到扩散方程Dt = D0 (1+ kD*C)，并外推得到了无限稀释下的蛋白扩散系数D0。通过绘制Dt/D0的归一化图谱从而确定扩散相互作用指数kD。通过以下公式计算注射器的推注力:结果图2. 单一辅料与辅料组合对mAbC粘度的影响图2A(单一辅料): 加入75 mM的辅料后，可以观察到蛋白粘度有轻微的降低，但降粘效果不够明显，依然不能满足皮下给药的要求（25 mPas）。即使提高辅料浓度至原来的两倍，其粘度仍然过高。结果表明，单一辅料无法有效降低mAbC蛋白粘度。图2B(辅料组合):粉红柱和黄柱分别代表将阳离子辅料和阴离子辅料分别单独添加至蛋白制剂后测定的粘度。蓝柱代表加入辅料组合的理论粘度值。紫柱代表加入辅料组合后实际测试的粘度值。结果表明，通过辅料组合的协同效应能够有效降低mAbC蛋白粘度。调整辅料组合配比，提高降粘效果图3为mAbC归一化的扩散系数Dt/D0与蛋白浓度之间的关系图。斜率为0时表示蛋白没有相互作用，斜率的负值越小表明蛋白相互作用越弱。加入不同比例的E1和E5辅料组合后，斜率的负值明显减小，提示蛋白粘度降低。当两种辅料的比例为2:1时，降粘效果最为显著。图3. Dt/D0与蛋白浓度的关系辅料组合发挥降粘协同效应图4结果显示，将几种不同的辅料及其组合分别加入mAbD制剂中，可以观察到几种特定的辅料组合实际粘度值明显低于其理论累加值，说明辅料组合具有协同降粘作用。图4. 辅料组合对mAbD溶液粘度的影响粘度降低可显著提高注射性能图5. 粘度降低对注射力的影响mAbC：当使用27G针注射原始配方的150mg/mL mAbC制剂时，所需注射力为90N，约9公斤——即一个一岁小女孩的重量；添加行标BM和E3的辅料组合后，所需注射力降为35N，约3-4公斤——一只家猫的重量mAbD：当使用27G针注射原始配方的150mg/mL mAbD制剂时，所需注射力为140N，约14公斤——一只小袋鼠的重量。添加E1和E4的辅料组合后，所需注射力降为18N，约2公斤——一个蛋糕的重量辅料组合提高蛋白稳定性I: 强降解实验设计采用自身稳定性差的mAb C作为模型药物，进行强降解实验。将150 mM的单一辅料与包含75mM阳离子和75mM阴离子的辅料组合分别添加至80 mg/mL的mAbC制剂溶液中，置于40 °C，75%相对湿度的环境下，在第0天，第14天，第28天分别取样，通过SEC-HPLC测定单体含量。II: 强降解实验结果图6. 强降解实验后蛋白溶液外观（左图为添加单一辅料，右图为添加辅料组合）图6结果显示，在强降解条件下，使用辅料组合的蛋白溶液澄清度明显优于单一辅料，表明辅料组合应用能够有效提高蛋白稳定性。图7.SEC-HPLC检测强降解实验后的单体比例（左图为添加辅料组合，右图为添加单一辅料）图7左结果表明，经过28天的强降解实验后，使用了辅料组合的制剂与原始制剂配方有相似的单体含量，即降粘辅料组合对制剂的稳定性无负面影响。图7右结果表明，使用单一辅料E1对单抗mAb C的稳定性没有负面影响，但辅料E4和E5单独使用时，会降低抗体的稳定性，从而降低单体含量。默克高浓度蛋白粘度降低平台优势(VRP)助力皮下注射制剂开发，提高可注射性，病人顺应性IP专利保护技术平台Emprove Expert 辅料支持高风险应用，Emprove dossiers文档支持，快速响应法规要求强化下游工艺，提高过滤通量，过滤效率，回收率，从而提高整个过滤工艺经济性辅料组合发挥协同效应，显著提高粘度下降水平并且保持蛋白粘度与稳定性之间的平衡市面上实现高剂量皮下注射的不同策略综合对比1.默克VRP平台展现出制剂开发更简单，成本更低，上市速度更快等优势。2.默克VRP平台对比酶，辅助设备，可缩短1-3年开发时间，节省30-50%开发成本，加快药物商业化上市步伐。

复旦大学于敏教授课题组《AJPS》：高精度3D打印用于抗凝药物重组水蛭素 (r-hirudin) 新型微创无痛递药系统的设计制备抗凝治疗通常被用作心脑血管疾病治疗的首选策略，且此类患者大多需要长期甚至终身服用抗凝药物。直接口服抗凝剂有导致胃肠道出血的风险，尤其是对于有胃肠道疾病如胃肠道溃疡的患者，这种出血是致命的。皮下或静脉注射给药或可规避胃肠道出血的风险，但是注射给药需专业人员辅助，这对长期用药的患者而言极其不便，注射引起的疼痛亦会导致患者用药依从性较差。此外，皮下注射抗凝剂还会导致皮下出血淤青，增加感染风险，给抗凝药物临床应用带来了极大的不便。透皮给药作为一种前瞻性给药策略，可以补充注射和口服给药的局限性 (图1)。图1. 临床抗凝药物给药方式及不良反应微针 (Microneedle，MN) 作为微米级的微创设备，可通过破坏皮肤最外层角质层产生短暂的疏水性毛孔，将治疗药物输送至表皮中，被认为是最有前途的透皮给药系统之一。目前，微针的制备主要通过微模型浇铸法，但是用于微模型制备的方法大多局限于光刻或者化学蚀刻，工艺复杂、周期长且成本高，限制了微针的多样性和个性化发展。高精度 3D 打印是近年来新兴的一种微模型制备方法，由于该法简单高效且成本相对较低，已广泛应用于生物医药的各领域，为微针阵列模型的设计制备提供了新的选择。图2.微针阵列模型的设计与打印 A. 1#微针阵列模型的计算机模拟(左)、打印预览(中)及3D 打印微针的长度(右)；B.2#微针阵列模型的计算机模拟(左)、打印预览(中)及3D 打印微针的长度(右)；C.设计模型和打印模型对比 近期，复旦大学代谢分子医学教育部重点实验室于敏教授团队联合复旦大学药学院沈腾老师提出了一种基于 3D 打印技术的微模型制备方法。该团队利用新型超高精度 3D 打印技术 (nano Arch P140，摩方精密) 实现了个性化设计的微针阵列模型的制备，并通过开发一条新的模型复刻工艺成功制备了基于 3D 打印模型的微针模具，最终制备了 r-hirudin 新型微创无痛递药系统。该方法成功解决了以光敏树脂为打印材料的微针阵列表面 PDMS 无法固化导致的模型翻制问题，同时进一步拓展了 3D 打印在微针阵列设计制备领域的应用。利用高精度 3D 打印制备的微针阵列拥有较高的分辨率，打印的微针形貌特征保留完整、尺寸均一，为载药微针的定性与定量分析奠定了基础。相关成果以“Design and fabrication of r-hirudin loaded dissolving microneedle patch for minimally invasive and long-term treatment of thromboembolic disease” 为题发表在《Asian Journal of Pharmaceutical Sciences》期刊上。 在该研究中，首先利用计算机辅助的模型设计对目标微针阵列进行设计优化，分别按需设计了两款不同参数的微针阵列模型，如图 2A所示，考虑到 3D 打印分辨率的限制，绘制微针长度为 1000 μm，允许微针有 100-200 μm 的长度损失，设置微针形状为五棱锥形，底边长度分别为 150 μm 和 100 μm，将微针有序排列成 10 × 10 的微针阵列 (图 2B)。将设计图纸输出导入 3D 打印软件进行打印，最终获得基于光敏树脂的微针阵列模型。与设计模型相比，微针的高度发生了100-200μm 的损失 ，但在允许范围之内，微针针体形貌保存完整，不同微针个体尺寸均一 (图 2C)，提示高精度 3D 打印在微针阵列模型制备方面具有巨大的应用潜力。图3.微针模具及 3DMN 制备流程图 由于以光敏树脂为打印材料的微针阵列模型在用 PDMS 进行模型翻制时在接触表面 PDMS 无法固化，所以选择明胶作为中间过渡材料替代直接使用 PDMS 进行微针模具制备，开发一条新的模型制备工艺(图 3)，并通过该路线成功制备了微针制备模具。将该模具应用于r-hirudin 递药系统的制备，通过连续的微模型浇铸并辅以恒温真空制备r-hirudin 荷载的 3DMN。对 3DMN 进行表征分析并在实验动物体内进行微针给药的药效学与药物代谢动力学分析，结果显示 3DMN 给药可以实现快速的透皮药物递送，血药浓度在给药后 0.5 h 达到峰值 (图 4D-F)，血液的凝固时间在 3DMN 给药后显著延长 (图 4A-C)。对 3DMN 给药的生物利用度(BA) 进行分析，发现 3DMN 给药相对于皮下注射给药的BA可达50% (图 4G-F)。该结果初步验证了基于高精度 3D 打印的微针阵列模型制备的 3DMN 在介导透皮 r-hirudin 递送中的可行性。 图4. 3DMN 介导的r-hirudin 透皮递送的体内药效学与药物代谢动力学研究 A-C. 血液凝固时间随给药时间的变化；D-F. 血清 r-hirudin 浓度随时间变化曲线；F. 不同给药方式血清药物浓度随时间变化曲线 G. 不同给药方式血清药物浓度参数 进一步研究 3DMN 在血栓性疾病防治中的应用，分别构建肾上腺素/Ⅰ型胶原混合物尾静脉注射诱导的急性肺栓塞动物模型和三氯化铁损伤诱导的肠系膜微动脉血栓动物模型，将载药 3DMN 用于动静脉血栓的预防性治疗，研究发现3DMN 介导的r-hirudin 用药可以显著抑制急性肺栓塞模型小鼠肺部血管栓塞的形成 (图 5C-D)，提高小鼠的存活率 (图 5A-B)。此外还观察到，3DMN 介导的 r-hirudin 用药同样可以显著三氯化铁损伤诱导的肠系膜动脉血栓的形成，降低血栓发生率 (图 6)。以上结果进一步说明 3DMN 可用于动静脉血栓的预防性用药，而高精度 3D 打印技术的出现不仅丰富了微针多样性，也为未来临床用药个体微针量身定制提供了基础，具有极大的经济效益与社会效益。图5. 3DMN 在预防急性肺栓塞中的应用A-B. 3DMN 给药对急性肺栓塞小鼠生存率的影响；C. 小鼠肺部组织石蜡切片 HE 染色；D. 小鼠肺部 CT 扫描图图 6. 3DMN 在预防肠系膜微动脉血栓中的应用 A. 血小板在血管损伤部位聚集的体内成像；B. 血栓形成率的统计分析图；C. 血栓形成长度统计分析图官网：https://www.bmftec.cn/links/10

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