高速均质器

随着经济和技术的不断发展，在十一五期间，仪器仪表行业也呈现出日新月异的面貌。数据显示，十一五期间，我国GDP年均增长为11.2%，而仪器仪表行业却实现了年均20%的超高速增幅，确实让仪表人十分欣喜。　　　　仪器仪表行业之所以能如此快速的发展，其原因不外乎以下几个方面：首先，整个国民经济的迅速发展，两化融合的进一步加深，带动了各个经济领域对自动化的需求，从而也带来了仪器仪表产业的繁荣。具体来看，国家重点工程项目的实施，食品及医药安全等关系国计民生问题的凸显，都为在制造装备智能化、生产过程自动化以及质量监督检疫环节中起到至关重要作用的仪器仪表提供了机遇。其次，十一五期间，国内仪器仪表技术的显著提高，致使部分国外市场份额逐步被国内市场取代，增加了国产仪器仪表的市场占有率。第三，中国市场对于仪器仪表的需求使得许多跨国公司十分重视中国市场这块蛋糕，越来越多的国外企业开始在中国开设工厂。从此前需要进口的产品转化为本土化生产，在一定程度上扩大了仪器仪表行业的市场规模。　　　　然而，随着国际经济环境的持续恶化以及国内市场环境的不稳定性因素，如钢铁、水泥、玻璃等产业出现的产能过剩，风电、太阳能、轨道交通及食品等领域相继暴露出的安全隐患，致使仪器仪表行业也开始呈现出降温趋势。十二五期间，仪器仪表行业将如何发展，成为业内人士不得不关注的重点。　　　　核心技术缺失市场竞争堪忧　　　　尽管在国家宏观调控政策的引导下，我国仪器仪表行业在近年来得到了前所未有的快速发展，然而核心技术的缺失，高尖端产品仍然依赖国外进口等问题的凸显，使得我国仪器仪表行业面临严峻考验。　　　　在近期的一个交流中，中国仪器仪表行业协会顾问董景辰向记者指出：其实早就有人看到，仪器仪表行业企业小、散、乱的状况是阻碍行业发展的重要原因之一。但是在经济快速发展时期，市场需求很大，小、散、乱企业生产的产品也都能销售出去，因此企业没有动力，也没有需求来改变这一现状。事实上，市场经济的无序竞争确实要为仪器仪表行业的现状买一部分单。然而，由于企业实力不强，造成在技术研发和制造过程方面的投入严重不足，致使国内产品和国外相比还有很大差距却是更主要的原因。　　　　对此，福建联合石油化工有限公司仪器仪表维护部经理涂胜华先生就向记者透露：目前国内仪器仪表企业与国外大型企业相比还是具有一定差距，尤其在产品性能上。对于我们石油石化行业而言，我们将会更加注重产品的可靠和安全，而国外的技术能够更好地确保我们生产过程的稳定，因而在选择合作伙伴时也更倾向于选择产品和可靠性高的国外企业。　　　　的确，涂胜华先生的顾虑也正是大部分用户的担心所在。发展至今，中国仪器仪表行业的大部分技术和产品研发都还处于跟踪国外的状态，国内少有能够和国际知名企业PK的技术，因而在用户选择产品时，尽管国内企业凭借价格优势占据了一部分市场，但是在大型项目面前，国内企业的技术不足使其在面对竞争之时难免被动，市场竞争压力倍增。

高速PCR技术赵晓光 薛燕（国家生物医学分析中心 北京 100850）摘要 PCR技术是现代分子生物学最基础的技术之一，在实现扩增效果的同时如何缩短PCR的实验时间成为实验工作者亟待解决的问题。本文从高速PCR的概念入手，阐述了实现高速PCR 仪器技术的原理、优势，及可能的应用。指出了高速PCR技术的核心在于，不仅要提高PCR仪器的升降温速率，更重要的是提高PCR样品温度与金属样品槽的一致性，从而达到缩短变性，退火，延伸等停留时间的目的，进而大大的缩短PCR时间。同时也指出，高速PCR对提高反应特异性带来的好处等。关键词 PCR；高速PCR；自适配技术；产物特异性中图分类号TH77 Rapid PCR TechnologyZhao Xiaoguang,Xue Yan(National Center of Biomedical Analysis,Beijing,100850)AbstractPCR technology has been one of the basic and key technologies of Modern Molecular Biology. How to shorten PCR time is a question badly needed to be solved on the premise of PCR amplification effect. In the paper we describe the concept, principle, advantage and application of rapidPCR technology which can highly increase the PCR speed. As addressed in the paper, the Key of rapid PCR is not only to increase the heating and cooling rate of PCR machine, more important, it relays on reducing the temperature difference between the PCR module and sample solution, so that the holding time of denaturation, annealing, elongation could be shorten, and the whole PCR time could be shorten dramatically. While, rapid PCR could also lead to another benefit to improving the specificity of PCR.Key words PCR；rapid PCR；Self-Adapting-Container technology；product specificity 1.PCR仪的温度控制 PCR(Polymerase chain reaction：聚合酶链反应)即是在体外模拟体内DNA复制的过程，用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增[1]。PCR反应通常在热循环仪（DNA扩增仪、PCR仪）中的小型反应管，以10-200 微升的反应量进行。热循环仪对反应管进行加热和冷却，达到每个反应步骤所需的温度。一个常规PCR扩增温度循环：94℃变性保持1分钟；55℃退火保持2分钟；72℃延伸保持2分钟，一个循环持续5分钟。热循环仪的变温方式和性能是PCR技术的核心与关键，直接决定PCR的效率和DNA产物的质量与数量。自1985年Mullis等人发明PCR技术以来，出现多种变温方式的PCR仪[2,3]，哪一种变温方式也难十全十美，目前主要有两种变温方式的PCR仪，一种是AB、伯乐、耶拿、Eppendorf、Biometra等公司的PCR仪所采用的半导体制冷器（peltier：帕尔帖）的PCR仪；另一种是以罗氏和corbett等公司采用专利的离心空气浴PCR仪(由于数量较少，本文暂不讨论)。温度控制的主要参数包括；温度的准确性、均匀性和升降温速度。 采用半导体制冷器[4]的PCR仪利用半导体制冷器既可以加热又可以制冷的特点，经过导热介质金属样品槽，控制PCR样品管的温度。主要特点：金属样品槽（银或铝）热传递速率快、易于自动化（没有机械部件）、体积小、控温简单、稳定可靠、环境影响小。主要缺点是金属样品槽的均匀性不好，大部分产品的温度均匀性只能控制在± 0.3℃左右。近几年这类产品的一个主要突破就是升降温速度的提高，这也是许多厂家喜欢大力宣传的指标，主要原因是关键部件半导体制冷器升降温速度的技术突破，表1是目前几种主要PCR仪的温度指标。其中尤以耶拿SpeedCycler2 PCR仪最为突出，升温速率高达15℃/sec，降温速率10℃/sec，在8-15分钟内即可完成标准的30个PCR循环，创建了高速PCR的业界新标准 。当然高速PCR不仅仅是节约时间，同时也具有应用意义！ 表1. 几款常规PCR仪的主要温度参数 品牌Analytik JenaABIBioradEppendorfBiometra型号SpeedCycler² Veriti 96 Well FastC1000Mastercycler pro sTprofessional升温速率最大15℃/s5 ° C/sec5℃/s6 ° C/sec最大6℃/s降温速率最大10℃/s4.25 ° C/sec5℃/s4.5 ° C/sec最大4.5℃/s样品槽材质银质镀金合金铝质蜂巢式银质纯银镀金加热元件高速PeltierPeltierPeltierPeltier，三组回路技术Peltier温度控制范围4 ° C- 105 ° C4-99.9℃0-100℃4-99℃3-99℃控温准确性&le ± 0.2℃± 0.25℃± 0.2℃± 0.2℃± 0.1℃控温均匀性&le ± 0.3℃at 72℃0.5℃± 0.4℃± 0.3℃at 20-72℃ ± 0.15℃at 55℃ ± 0.25℃at 72℃ ± 0.4℃at 95℃ 2.高速PCR的标准与意义 高速PCR[5]这一概念最早是由在PCR和定量PCR技术领域享有盛誉的快速PCR先驱者、美国犹他大学的Carl Wittwer教授在二十世纪九十年代提出的，他认为在30分钟内完成30个循环的PCR扩增实验，才可称之为高速PCR。现在该定义已经被业界广泛认可接受，成为衡量是否为高速PCR的标准。 众所周知，目前常规PCR仪运行一个完整的PCR实验大约需要1～3小时，一天下来只能做3～4次PCR实验，这对于样品量大或使用者多的实验室来说，安排实验工作就非常不方便，严重影响工作效率。而高速PCR可在8-30分钟内即可完成一个常规PCR实验，大大缩短了PCR实验的时间，别小看这节约下来的几十分钟，一天下来就可以多运行好几轮了。而且缩短PCR反应时间，对医院、生产线产品质量控制、现场检测和应急处理等对时间敏感的场合，更有实用意义。 除了反应速度快外，高速PCR的另一个突出优点是可以提高PCR产物的特异性。影响PCR产物特异性的因素有很多，其中引物和模板的正确配对是最为关键的，而这又与引物的退火温度和时间密切相关。在退火温度一定的条件下，退火时间越短，越有利于提高准确配对的引物-模板的比例，进而提高扩增产物的特异性。由于高速PCR技术能使样品温度在非常短的时间内达到设定温度，所以可以大大缩短退火时间，进而扩增出高特异性的PCR产物。3.高速PCR仪的原理与关键技术 为什么普通PCR仪的PCR反应需要1～3个小时呢？比如扩增1kb片段的目的基因，常规的PCR程序为：95℃ 预变性2min，95℃ 变性30s，58℃ 退火30s，72℃延伸1min，30个循环后再充分延伸2min。即使不考虑升降温变化所需的时间，单纯计算PCR三个步骤所需的时间，一次循环需2min，30个循环也需要60min。有个问题可能有些人没有想过，为什么变性－退火－延伸的步骤必须停留那么长的时间？缩短一点行不行？主要原因是热量从仪器传递到样品要通过半导体制冷器&rarr 传热介质金属样品槽&rarr 样品管&rarr 样品几个环节，而每个环节的热传递效率都会影响样品的实际温度变化，一般情况下样品的温度变化与加热模块相比会有时间上的滞后。当金属样品槽达到了设定温度时，样品实际温度还远远没有达到设定温度。图1为普通PCR仪金属样品槽温度和样品实际温度之间的差别，从中可以清晰地看出这一现象，当样品槽温度达到设定的50℃时，样品的实际温度还在65℃左右，而15s后，两者的温度还有1.5℃的差别。所以进行常规的PCR时，各步骤的停留时间必须足够的长，以使样品的温度达到设定的温度。 图1 普通PCR仪样品槽温度和样品实际温度之间的差别 所以要实现高速PCR反应，就必须解决两个关键问题，提高PCR仪的变温速率和热传导效率。这要取决于基础器件、材料、技术和方法的突破与创新。仪器方面，最主要的是高速大功率半导体制冷器的技术突破，因为他是PCR仪温度控制的源动力和高速PCR的根本。金属样品槽采用导热性好的银材质，由于银的热传导速率两倍于铝，银槽PCR仪的升降温速度及温度均匀性明显优胜于铝槽，银槽再镀金以避免银被氧化，可以最大幅度地提高银槽的导热效率。选择薄壁PCR管和减少反应体系，也可显著提高PCR管内样品的温度响应时间。在追求PCR速度越来越快的同时，反应体系越来越少也是一大发展趋势，这不仅可以节省样品和试剂用量，还可以加快样品的温度变化，和水壶里的水越少越容易烧开是一个道理。以前PCR反应体系通常为50µ L，后来改进为25或20µ L，现在已经有一些产品的反应体系能降低至5-10µ L，这也是实现高速PCR的一个前提条件。 金属样品槽导热虽然好，但是与反应管，很难做到无缝接触，影响样品槽和样品间的热传递效率。各厂商生产的PCR仪金属样品槽和PCR管也多少有些不同。这也是为什么有些厂家会推荐使用者使用某种特定品牌的样品管的原因。针对这个问题，耶拿公司推出专利的自适配容器技术（SAC：Self-Adapting-Container）。基本思路是让样品管形状适应样品槽的形状，随样品槽的形状而变化。技术关键是采用聚丙烯材料制成管壁仅50µ m极薄且富有弹性的PCR管，在PCR加热过程中，管内空气受热膨胀而对管壁施加压力，管壁就会像皮肤一样紧密贴合在样品槽上，实现无缝接触，如图2所示，使热量能快速穿过极薄的管壁传递到样品上，使样品温度和样品槽温度几乎同步变化，如图3所示，从而可大大缩短PCR循环各步骤的停留时间，把先前的几十秒缩短到几秒，进而实现高速PCR。可能处于专利的考虑，这种PCR管只能在耶拿自己独有的一种低缘紧凑型的银质镀金样品槽上使用，由于这种样品槽的深度仅有5mm，减少了银质镀金样品槽的质量，因而进一步提高了银质镀金样品槽与半导体制冷器之间的温度响应速度。比如说上述的常规PCR程序，如果改用SAC高速PCR技术，可实现变性2s，退火2s，延伸10s，升降温变化速率大于10℃/s，30个循环可以在25min甚至更短的时间内轻松完成。 PCR反应前 PCR反应期间 图2 PCR开始后，自适配样品管壁会紧密贴合在样品槽壁上，实现能量的快速传递 图3 高速PCR过程中，样品温度与加热模块温度几乎保持同步 在此，大家可能会产生一个疑问，高速PCR是否要使用特殊的高速PCR聚合酶？将延伸时间或退火停留时间缩短，是否可保证聚合？众所周知，延伸时间是受扩增产物的长度决定的，大家形成的常规概念是按1kb/min来设定。但实际上，普通Taq酶的扩增效率大约为35-100bp/s，扩增1kb仅需要10s-30s。 因此，如果产物长度在300bp，而且采用热平衡时间很短的高速PCR仪，10s的延伸时间就已足够。问题是常规PCR中，要保证样品温度要在延伸温度下停留10秒，须将模块温度停留30秒以上才能实现，而高速PCR由于保证了样品温度和金属样品槽温度的一致性，因此，将模块温度停留10秒即可。另外，近年来一些公司推出了一些快速的Taq 酶，例如，Bio-rad公司的Ssofast酶, Takara的TaKaRa Z-Taq酶等，这些酶的扩增速度比普通Taq酶快5-10倍，使用这些酶，使用高速PCR仪时，延伸时间可以进一步缩短。4.结束语 PCR技术在生命科学研究领域是一个非常基础又非常重要的技术，随着各种应用需求越来越多，人们对能拥有一台速度快、样品量小、产物特异性好、试剂无特殊要求、操作简便的PCR仪的要求也越来越强烈，高速PCR技术将在不断地改进创新中成为PCR发展的一个必然趋势。参考文献[１]黄培堂，俞炜源, PCR 技术原理和应用. 北京: 中国科学技术出版社, 1990：1- 9[２]张文超.聚合酶链反应（PCR）技术与基因扩增分析仪器（PCR 仪）.生命科学仪器，2005 第3 卷第3 期[３]章春笋，徐进良.时域式PCR生物芯片中温度动力学研究进展.现代科学仪器，2005（03）：13-17[４]王南林，吴太虎.半导体制冷与医疗仪器. 医疗卫生装备,2002，6：２８－３０[５]Wittwer，C.T.et al., in Mullis, K.et al.,(Eds.). The polymerase chain reaction. Birkhauser, Boston(1994)：174-181[6]高惠兰，方福德.聚合酶链反应技术.现代科学仪器，1993（01）07-10 收稿日期：2011-08-22作者简介：赵晓光，男，主要研究方向：分析仪器

p　　散裂中子源、强磁场装置、同步辐射光源、大型天文望远镜……近年来，一项项神秘的大科学装置陆续建成并投入使用，它们或隐世于高山峡谷，或藏身在喧嚣城市的地下，虽然不被世人所熟悉，却自带耀眼的光环。它们作为重大科技基础设施，伴随着一项项大科学计划，缔造着中国乃至世界科学的未来。/pp　　这些大科学装置何以成为“国之重器”?它们究竟发挥着怎样的作用?又将承载什么样的使命?/pp　　strong大科学装置发展进入快车道/strong/pp　　在国家蛋白质科学研究(上海)设施运行之前，中国科学家想要完成蛋白质结构的解析，只能去日本、美国。而现在，一批又一批跨国企业和国外优秀科学家纷纷来到中国，使用国家蛋白质科学研究(上海)设施的设备和服务开展前沿课题研究，一系列诞生于此的重要成果发表在Nature、PNAS等高水平国际学术刊物上。/pp　　国家蛋白质科学研究(上海)设施何以有如此吸引力?这项大科学装置集中了我国自主研发的规模化蛋白质制备系统，实现了蛋白质制备全流程的高度集成和流水线作业，而且在样品处理通量上超过半自动化系统10倍、超过传统的人工系统100倍，居于国际领先水平。因此，它很快就成为国际上有重要影响的大型综合研究创新基地，也是我国科学家探索生命奥秘的利器。/pp　　作为当今全球生命科学领域首个综合性的大科学装置，国家蛋白质科学研究(上海)设施能够满足80%以上研究用户的需要。在开放试运行的第二年底，就已经执行用户课题800多个，服务150多家单位，各系统累计运行95000多小时。/pp　　从无到有、从小到大、从学习跟踪到自主创新，这些年，我国一大批大科学装置横空出世，惊艳世界。中国“天眼”FAST，500米口径球面射电望远镜，将覆盖30个足球场大小的信号，聚集在药片大小的空间里，实现了新的突破 中国西南野生生物种质资源库，主要收集和保存云南及周边地区和青藏高原的种质资源，与世界其他著名的种子库相比，是唯一建立在“生物多样性热点地区”的种质资源库 上海同步辐射光源，是世界上性能最好的第三代中能同步辐射光源之一……/pp　　这些各领风骚的大科学装置不但覆盖面越来越广，包括时间标准发布、遥感、粒子物理与核物理、天文、同步辐射、地质、海洋、能源和国家安全等众多领域，而且近年来装置设施的数量、建造规模也逐步扩大。中科院高能物理研究所北京正负电子对撞机国家实验室主任陈和生表示，我国的大科学装置发展已经进入快车道，取得了很多重大科学成果，有些已经处于国际领先地位。/pp　　这批“国之重器”为研究物质结构提供了最先进的技术手段，支撑着国内外科学家开展物质基本结构、宇宙起源与演化、生命起源等重大科学问题的探索，在世界科学研究的舞台上熠熠生辉。/pp　　strong“神兵利器”带来累累硕果/strong/pp　　对于大科学装置，建好仅仅是开始，用好才是关键。大科学装置陆续投入使用，满足了国内日益增长的科研需求。/pp　　自上世纪90年代以来，中科院高能物理研究所借助北京正负电子对撞机，获得了多项重大成果，居于国际领先水平，成为世界领先的高能物理研究中心之一。同时还“一机两用”，成为我国众多学科的同步辐射大型公共实验平台。/pp　　上海光源一期虽然只有7条光束线站，但是自2009年建成后需求极大，去年已有近400家单位、1万多人成为用户，线站供不应求，取得了众多有价值、有影响力的科研成果。从地域分布上看，上海光源的用户几乎覆盖我国所有省区市，还有10多个国家和地区的科研人员以合作形式来到这里，开展研究工作。/pp　　有这些“神兵利器”加持，我国的科研水平迅速提升，取得的成果日益丰富。/pp　　世界最大单口径、最灵敏的500米口径球面射电望远镜(FAST)落成启用，大幅提升我国深空测控能力。上海超强超短激光实验装置达到国际最高激光脉冲峰值功率，合肥稳态强磁场装置实现了40万高斯稳态强磁场，全超导托卡马克装置(EAST)创造聚变等离子体稳态高约束模大于60秒的世界纪录，大亚湾中微子实验发现了新的中微子振荡并精确测量其振荡几率。/pp　　除了大科学装置结出的累累硕果外，反观大科学装置的存在本身，已经远远超出一件新“神器”的意义。因为它们本身就集成了许多科学前沿领域的重大原创突破，凝聚了各个方面的创新驱动力，培育了一批科研后备力量。它们更多在发挥着“科技航母”的关键作用，直接促进了大批原始创新成果、核心关键技术的产生。/pp　　当承建单位研发出符合FAST要求的新钢索时，申请了12项专利 上海光源不仅推动生命科学、材料科学、环境科学等多学科领域科技创新，还对现代高性能加速器、高精密机械加工、X射线光学等先进技术和相关产业升级起到了重要作用 不少过去参与北京正负电子对撞机建造的厂家现在已经成长为领军企业，他们都谈到，当年对撞机的建造对于企业自身生产工艺带来很大提升。/pp　　每建设一项大科学装置，对我国工业基础就是一次严峻的考验。在高标准的技术要求筛选下，大科学工程建设培养和汇聚了一批国内最牛的施工单位和高技术企业，它们边“追赶”边“补课”，创造了一个又一个“中国制造”的奇迹。/pp　　strong面向未来抢占科技制高点/strong/pp　　从2011年9月到2015年6月，经过3年多巡天，LAMOST共观测了2669个天区，对外释放了约570万条光谱数据，成功获取高质量恒星光谱462万个，比世界上所有已知光谱巡天项目获取的数据总数还要多，让我国占据了学术的高地。/pp　　当LAMOST在探望苍穹之时，一艘名叫“科学”号的海洋科学综合考察船桅杆高立，威武浩荡地驶向大海。目前，借助“科学”号，科学家已经成功开展了西太平洋冲绳海槽热液、南海冷泉、主流系、马努斯海盆和雅浦海山等航次综合调查，获得了大量珍贵的海洋资料。/pp　　不同领域的先进科技装备使我国走向自主创新高地，抢占科学前沿阵地。这些集“颜值”与“实力”于一体的大科学装置，代表着各种大型复杂科学的研究系统，为科学家探索未知世界、发现自然规律及实现技术变革提供极限研究手段，也是经济社会发展不可或缺的技术基础设施。它们推动了我国粒子物理、核物理、生命科学等领域的科研水平进入国际先进行列。通过发挥大科学装置的最大能量，让我国在国际合作与竞争中更具话语权，更好地参与国际前沿科技的竞争。/pp　　如何帮助人们远离越来越频繁发生的灾难?在煤炭、石油等资源枯竭后，人类将依靠什么能源继续生存下去?怎样保持这颗美丽星球的生物多样性?这一系列未知的难题，大科学装置正在一一破解。/pp　　EAST，是我国自行设计建设的世界首个“全超导托卡马克”核聚变实验装置，被誉为“人造太阳”。据中科院合肥分院等离子物理研究所助理研究员鄢容介绍，依靠环形磁场作为“容器”，聚变原料实现可控的核聚变反应，获得大量能量，进而得到清洁能源。“核聚变的原料从海水中提取，非常安全，一升海水可以提取33克原料，相当于300升石油释放的能量。海水里的核聚变原料非常丰富，可以供人类使用上亿年。”鄢容说。/pp　　不仅未来可期，当前人类已经在大科学装置的建设中受益。如今，一种新的治疗癌症的方法诞生，它利用高速的重离子束对病变组织进行治疗。重离子治疗癌症是当代世界上公认的先进有效的放疗方法，与传统的放射治疗相比，重离子束对健康组织辐射损伤轻、疗程短、治愈率高。而重离子治疗技术的开展，正是依托于一个属于“大科学装置”的机器——重离子加速器。/pp　　这批重大科技基础设施，不光是高高在上的科研利器，它还解决了一批关乎国计民生和国家安全的重大科技问题，在载人航天、资源勘探、防灾减灾等方面也发挥着不可替代的作用。可以说，大科学装置正在加速改变我们的现在和未来。/ppbr//p