大鼠支气管上皮细胞的知识与应用及其培养操作！

                   大鼠支气管上皮细胞的知识与应用及其培养操作！

一、背景

大鼠支气管上皮细胞是构成大鼠呼吸道的重要组成部分，主要位于支气管内壁。这些细胞在维持呼吸道功能、防止病原体入侵以及参与气道免疫反应等方面发挥着关键作用。

在生物医学研究中，大鼠支气管上皮细胞被广泛用于模拟和研究人类支气管上皮细胞的生物学特性、功能以及疾病发生机制。这些细胞可以用于研究呼吸道感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等呼吸道疾病的发病机制和治疗方法。

为了获取大鼠支气管上皮细胞，研究人员通常需要通过特定的方法从大鼠的支气管组织中分离和培养这些细胞。培养过程需要特定的培养基和条件，以确保细胞的生长和活性。

在实验室环境中，大鼠支气管上皮细胞的培养和实验操作需要遵守严格的无菌操作和细胞培养规范，以确保细胞的纯度和实验结果的可靠性。

二、大鼠支气管上皮细胞培养操作

1)复苏大鼠支气管上皮细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠支气管上皮细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠支气管上皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

大鼠支气管上皮细胞可以用于PERK/eIF2α通路负调控内质网应激抵抗COPD气道上皮细胞凋亡的机制研究：

体外研究发现在PERK/eIF2a这条通路被敲除后,细胞对内质网应激所致凋亡敏感性增加,而增强PERK/eIF2a通路,细胞凋亡减少,证明上调PERK通路在ERS中具有对抗细胞凋亡的作用。基于目前在COPD发病中,PERK/eIF2a通路在内质网应激诱导的细胞凋亡中如何作用,其与CHOP、caspase关系尚不明确,拟以COPD大鼠及香烟烟雾提取物(CSE)干预大鼠支气管上皮细胞(HBE)为主要模型,探讨PERK通路相关信号分子、凋亡信号指标及之间关系,研究PERK通路的活化剂salubrinal在其中的作用,旨在证实PERK通路在COPD内质网应激诱导的细胞凋亡中具有重要作用,为临床治疗COPD提供新的理论基础和治疗靶点。

PERK/eIF2a通路在COPD大鼠支气管上皮细胞大鼠支气管肺组织中凋亡中的作用目的：观察PERK通路在COPD大鼠内质网应激所致支气管肺组织是否活化及salubrinal对香烟烟雾所致气道上皮细胞凋亡的影响。

方法：36只Wistar大鼠随机均分为3组：正常对照组、COPD模型组、COPD模型加药物组(简称干预组)。采用被动吸烟加气管内滴注脂多糖(LPS)法建立大鼠COPD模型,药物组在滴注脂多糖的同时气管内滴注salubrinal(1mg/kg)。造模完成后,测定各组大鼠的肺功能；观察肺组织病理学变化；大鼠支气管上皮细胞免疫组化检测p-PERK、p-eIF2a、caspase-12在支气管肺组织中的表达和分布；western blot检测p-PERK、p-eIF2α、active caspase-12和active caspase-3蛋白水平；TUNEL法检测支气管肺组织上皮细胞凋亡。

结果：模型组的各项肺功能指标较正常组均明显降低,但以salubrinal干预后大鼠各项肺功能指标较于模型组有明显升高。在模型组中内质网应激PERK通路的指标p-PERK、p-eIF2a较正常组相比增高,而干预组的p-eIF2a的表达水平最高；模型组的大鼠支气管上皮细胞凋亡指标active caspase-12和active caspase-3表达较正常组明显升高,干预组凋亡较模型组减少。

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