再次突破创新！浅谈唯公编码微球的发展历程

近期，唯公的磁性荧光编码微球（液相芯片）（EasyMagPlex）再次取得突破，其可自动分析的编码数量达到84重，并将码微球表面活性基团的种类从单一的羧基扩展到了羧基（亲水，疏水），链霉亲和素、氨基、环氧基、甲苯磺酰基等，即将上线“喀斯玛商城”。唯公编码微球的升级给客户和合作伙伴提供了更多的选择，再次引领国产磁性编码微球！

EasyMagPlex 84重编码微球散点图，在EasyCell上的散点图

从1990年代起，国内就陆续有编码微球相关的专利和优秀文章发表，但一直未见国产编码微球商业化。直到近年唯公突破了Luminex技术壁垒，成为国内第一家（全球第二家）拥有自主知识产权并实现了磁性荧光编码微球商业化的公司。近年来，国内也有不少公司以唯公为标杆，奋起直追，一起推动流式荧光应用和发展^[1-2]。

通俗地讲，磁性荧光编码微球，是一种以超顺磁性微球为基础，通过微球的不同荧光波长及发光强度来区别不同种类（编码）的磁性微球。严格地讲，微球可具有多个荧光发光光谱，可以是单粒径或多粒径，所有在流式分析仪上可区分的微球特征都可以是编码的参数。在常见的编码微球应用中，主要是以单粒径微球为基础，采用流式中红光激发的荧光为编码通道，用蓝光（或绿光）激发的荧光（如，PE荧光素）为检测通道。也有公司在荧光编码数量不能满足要求时，引入不同粒径的微球来增加编码数量。

各种编码参数的优劣势：

一 、编码微球种类

市场上目前主要有三种编码微球：(1）Luminex磁性编码微球；(2）唯公编码微球（兼容主流流式磁性编码微球）；(3）兼容主流流式的非磁性编码微球。

1 Luminex编码微球，具有超顺磁性，它采用了一套特有的荧光素组合来编码微球，而这套荧光素组合无法完全被主流的流式分析仪上识别，需要专门定制的流式分析仪。通过知识产权保护，其封闭的编码微球组合和定制的检测平台垄断了流式荧光市场。使用Luminex的微球开发试剂通常需要获得Luminex的授权，并使用Luminex专用的检测仪器平台或光学模块。相对高昂的编码微球和专用的检测平台，限制了所开发试剂的使用及推广。

2 唯公编码微球（EasyMagPlex）除了具有超顺磁性，还在编码微球荧光素的选择上下了功夫，我们的微球在编码荧光通道兼容主流流式的荧光配置（例如唯公、碧迪、贝克曼等），现有的流式用户都可以成为基于我们微球而开发的流式荧光试剂的潜在用户，可以降低用户使用流式荧光试剂的门槛，无需额外采购其他专用设备。同时，在在唯公的设备上（EasyCell和EasyPlex），唯公的编码微球均可实现的自动分析，保证后续流式荧光检测的全流程自动化。为解决编码微球试剂样本制备时间长、操作流式复杂的痛点，唯公配套了全自动细胞因子样本制备仪（EasySampler C），其制备功能还可以通过调整流程，扩展到唯公的自身免疫抗体检测试剂、过敏原检测试剂等。对于唯公微球开发的试剂在其他主流流式上，唯公也有专门的分析软件（WellCKAS）可以对微球团族自动分析，自动建立标准曲线和自动分析结果。

3 兼容主流流式的非磁性编码微球，顾名思义，既可以兼容主流流式的荧光配置（例如碧迪、贝克曼、唯公等），但由于编码微球不具磁性，其样本制备自动化受到研发难度大、制造成本高等限制，让后续的样本制备自动化面临巨大的挑战。使用这类编码微球开发的试剂有碧迪、BioLegend和AimPlex的细胞因子试剂，样本制备必须手工操作，极易引入人为误差。

二、 编码微球数量

在对Luminex编码微球的商业宣传中，我们常常会听到Luminex可以编码500重的三维编码。这其实是一个误区，因为编码微球的目的是用来开发试剂的，不是用来数编码重数的。而且，Luminex的三维编码微球，对仪器设备又提出了更高的要求。选多少重的编码微球，要根据开发试剂的种类。常见的临床编码微球试剂很少能见到30重以上的联检，因为联检的重数超过30重，在试剂开发的过程中，要去解决待测物间的相互干扰的难度和所需的资源都会大幅增加。现有联检较多的细胞因子检测试剂、自免抗体检测试剂，过敏原检测试剂都不超过30重，选用唯公30重或50重编码微球系列就可以满足要求，对于特殊需求的科研试剂，唯公也有新开发的84重编码微球。编码重数适中，可以保证每个编码点（编码微球团族）之间有足够的分离间隙，不仅降低了编码点之间相互“串扰”，而且在一定的仪器、试剂批间偏差的情况下，还能保证了自动分析的准确性。

三、 编码微球粒径

在单粒径编码微球数量不足的时候，有的公司会通过不同粒径的微球对编码数量进行补充，以达到弥补编码数量的不足。另外，对于采用两种或多种粒径的微球编码组合，通常是通过前散/侧散信号先区分不同粒径的微球，然后再展开不同粒径微球的编码。在前散/侧散散点图中，小粒径微球在偶联/包被抗体/抗原后会形成部分二聚体或多聚体，会与大粒径微球在信号上重叠，被误计入到大微球中，从而对大粒径微球的检测项目产生干扰，影响检测结果。所以在选择不同粒径的编码微球组合时，要认真评估这种因微球粒径的影响而导致测结果不准确的风险。

对于不同粒径的微球，其比表面积不尽相同，反应动力学会有差异，且单位质量的微球的总表面积也会不一样。因此对应的最佳包被抗体量亦会有区别，需要不同的包被工艺和条件，对于试剂研发增加了一定的难度。再则，由于微球的表面积与微球粒径的平方呈平方关系，因此不同粒径的微球，其反应信号值差异很大。比如常见的约为3μm、6μm、8μm粒径的微球，以6μm微球的信号强度为1，则3μm球的理论信号强度仅为6μm球的四分之一。而8μm球则为1.78。如果所用的微球粒径跨度较大，则很难保证联检的信号在一个数量级上达成统一。

另外大微球（例如，8μm球）虽然在信号强度上能够提高，但在重量上，则大幅增加，如8μm球的重量要比6μm球重2.37倍！重量越重，沉降速度就会加快，对反应过程的混匀要求较高，否则大小不同粒径的球的免疫反应可能达不到均相，会影响检测结果。

最后微球会有一定的来源于材料本身的背景荧光信号，在检测荧光的PE通道上，微球粒径越大，在检测荧光通道（PE通道）的自发荧光信号（背景荧光信号）就会越高，直接影响检测试剂的检测下限。

唯公编码微球的发展历程

从唯公成立之初，我们就把突破Luminex编码微球的技术壁垒作为一项核心技术储备。2018年，我们陆续推出了7重和12重磁性编码微球。2020年我们自主开发的基于唯公编码微球的6/7/12细胞因子联检试剂也获证上市。

EasyMagPlex 7/12重磁性编码微球散点图

2021年唯公开始对外公开销售其30重磁性编码微球，并根据用户的需求，我们又大幅提升了表面羧基基团密度和耐超高温的性能。目前，唯公开发了“羧基密度通用版”、“羧基密度加强版”和“PCR适用版”，三套微球产品系列，不仅更富了我们的产品线，使之更有层次，更满足了不同用户不同项目的不同需求。在一些比较普遍（即抗原抗体研发相对成熟，反应性高，容易购买，价格便宜等）的项目上，羧基密度通用版的微球即可以满足要求。而对于羧基密度加强版的微球，则适用于一些原料较贵、不易购买或抗原抗体对信号值低的项目。可以将一些处于可用与不可用边缘挣扎的抗原/抗体对儿“抢救回来”。因此用户也不再需要选择大粒径来增加抗体/抗原的包被量，而用我们6um羧基密度加强版编码微球就达到了他们混用6um和8um编码微球的效果，同时避免了不同粒径微球的相互干扰。PCR适用版微球，提高了微球的在超高温和不同温度变化的环境下的稳定性，在PCR不同温度的实验过程中，微球的性能几乎无变化，可满足PCR不同反应体系的要求。

EasyMagPlex 30重磁性编码微球散点图，常规及高密度羧基基团性能编码微球比对

随着我们编码微球用户不断增多，科研客户特殊的需求也逐渐增多。2022年我们又固化了一套50重磁性编码微球的生产工艺，完成了量产转产，这套编码微球同样具有“羧基密度通用版”、“羧基密度加强版”和“PCR适用版”。

EasyMagPlex 50重磁性编码微球

近期我们有对我们的编码微球再次升级，完成了84重磁性编码微球的研发。与此同时，我们也完成了不同表面活性基团微球的生产工艺，将全部唯公微球表面活性基团的种类从单一的羧基扩展到了羧基（亲水，疏水），链霉亲和素、氨基、环氧基、甲苯磺酰基等，给用户提供了更多的选择。

EasyMagPlex 84重磁性编码微球散点图

由于Luminex是最早拥有编码微球技术的公司，我们也把我们的编码微球和Luminex的编码微球在前散/测试及APC编码通道上的一些性能进行了比对。

唯公编码微球和Luminex编码微球比对

因为编码微球是用来开发试剂的！试剂开发需要编码微球最少可以放置两年，而且不同批次的批间差要可控，要具有尽可能低的检测下限。在唯公编码微球的研发过程中，我们对编码微球的稳定性、批间差以及背景荧光信号进行了大量的研究。

一 、编码微球的稳定性

在试剂的开发过程中，编码微球是试剂开发的原材料之一。作为试剂原料，就必须能存放较长的时间，例如前面提到的两年，因为体外诊断试剂的效期最少都在一年以上。唯公的编码微球在37°C存放一个月后和新制备时进行了比较，其编码荧光值几乎不变。由此可见，我们的编码微球的稳定性可远超出了两年的要求。

EasyMagPlex的稳定性加速试验结果

二 、编码微球的批间差

我们对采用了同样的工艺的不同批次的三批编码微球，通过夹心法进行了批间差验证。其结果显示几乎没有差异，表明我们的工艺稳定，完全符合试剂开发的要求。

EasyMagPlex的批间差比较

三 、编码微球的背景荧光信号

众所周知，任何物质都会有自发荧光，编码微球也不例外。在检测信号通道（PE）上所能检测到的编码微球的自发荧光，我们称之为背景荧光信号（又称，背景噪声信号）。背景荧光越低，检测信号的信噪比就越好，对低值样本检测的干扰就越小，相应试剂的可检测下限就越低。在EasyCell同样设置的情况下，我们对Luminex的一维编码微球裸球和唯公的一维编码微球裸球进行了比对，发现EasyMagPlex在PE通道上的背景荧光信号要明显低于竞品。也就是说，基于EasyMagPlex开发的试剂，可达到更低的检测下限。

Luminex编码微球和EasyMagPlex的背景荧光信号比对

我们以唯公磁性编码微球开发的7重细胞因子联检试剂为例，展示一下唯公微球和国内竞品微球开发的5联检肿标微试剂球对比。可以看出唯公EasyMagPlex在不同待测物浓度下都有更清晰分离度，每个团族都更团聚，且有明显的分界区域（竞品的数据来自公开发表的文章）。除了编码通道的分离度（纵轴）外，唯公的EasyMagPlex在PE检测荧光通道（横轴）也非常聚集，这说明EasyMagPlex的均一性要明细优于竞品的表现。

国内竞品磁性编码微球5重肿瘤标志物联检试剂散点图

EasyMagPlex7重细胞因子联检试剂散点图

我还将唯公的基于磁编码微球7重细胞因子联检试剂和进口的基于无磁编码微球的两家试剂进行过比对（A公司和B公司）。通过比对可以看出，由于EasyMagPlex具有更低的PE背景荧光信号，我们的试剂在接近低端检测限（<2 pg/mL）时，依然有非常好的线性，优于进口试剂。

唯公的流式分析仪（EasyCell），全自动流式荧光分析仪（EasyPlex）均支持唯公编码微球的自动分析。为解决样本制备时间长、操作流程复杂的痛点，还配套了全自动细胞因子样本制备仪（EasySampler C）。EasySampler C不仅支持唯公现有细胞因子检测的样本制备，还也可以通过调整制备流程，扩展至其他唯公的流式荧光试剂，例如自身免疫抗体检测试剂、过敏原检测试剂等。同时，唯公还为其他主流流式（例如，碧迪、贝克曼等）配套了目前国内唯一获证的细胞因子分析软件（WellCKAS），WellCKAS也可以通过调整参数支持其他唯公的流式荧光试剂。

参考文献

1.前瞻者说|专访唯公科技李为公：打破国际技术垄断，国内免疫诊断迎来新“黄金赛道”，前瞻网（https://www.qianzhan.com），2021.12.31，

2.国产流式荧光突破技术壁垒，高通量多联检发展趋势可期——唯公科技创始人李为公博士，仪器信息网（https://www.instrument.com.cn），2023.04.10.