MS搬运工
近日,中国科学院深圳先进技术研究院司同课题组联合中国医学科学院杨兆勇课题组,在国际学术期刊 Chemical Science 在线发表了题为:Directed evolution of a cyclodipeptide synthase with new activities via label-free mass spectrometric screening 的研究论文。
该研究依托深圳合成生物研究重大科技基础设施(简称为“合成生物大设施”),开发了无标记质谱筛选技术,应用于环二肽合酶的定向进化改造,快速得到了 F186L 突变体催化合成野生型天然酶无法产生的新二酮哌嗪分子。
定向进化是酶工程的重要方法,需要开展反复多轮的突变文库构建和筛选。现有面向酶定向进化的高通量筛选方法,通常利用偶联反应、生物传感器等手段,将底物或产物浓度信息转化成光学、电化学等信号。开发筛选方法的过程不但费事费力,且通常需要使用衍生化、特殊标记底物等方法,不利于发现新的催化活性。另一方面,质谱分析基于离子的质荷比(m/z)对反应物进行定性与定量测定,具有更好的普适性。更为重要的是,基于无标记(label-free)原理,可以通过非靶向质谱方法识别新的酶促产物,从而发现对应的新催化活性。但质谱筛选的这一能力在酶定向进化中的应用还非常有限,主要限制因素是检测样品进入质谱仪之前通常需要经过耗时的样品制备和色谱分离步骤,限制了质谱筛选的通量
该研究依托深圳合成生物大设施的机器人平台,针对酶突变文库构建和筛选过程中的不同环节,如分子克隆、微生物培养、产物乙酸乙酯萃取、MALDI-TOF 质谱分析、数据处理等,开发了对应的自动化流程和方法,实现了微生物发酵产物的无标记质谱筛选,通量为每样品5秒钟(图1)。
图1:高通量、无标记质谱筛选用于酶新催化活性的定向进化研究
文章以环二肽合酶(cyclodipeptide synthases, CDPSs)为研究对象,验证无标记质谱筛选在酶定向进化中的应用。环二肽合酶利用氨酰-tRNA底物可以合成二酮哌嗪(diketopiperazines, DKPs)骨架;含有这类骨架的天然产物可以通过肠屏障、血脑屏障,是重要的药物先导化合物。然而,基于蛋白质工程改造环二肽合酶的成功案例非常有限,部分原因在于缺乏高通量的产物分析方法,相关研究仅限于少数理性设计突变。
研究团队以链霉菌(Streptomyces noursei)来源的 AlbC 作为研究模型,使用大肠杆菌底盘进行文库构建与筛选。重组表达野生型 AlbC 的大肠杆菌的主要环二肽产物为 cFL。作者首先利用半理性设计,选取底物结合口袋附近的10个位点及口袋外与 tRNA 密切作用的4个位点,构建和筛选了定点饱和突变(site-saturation mutagenesis,SSM),快速发现了多个产物谱发生明显变化的突变体。其中,有文献报道的8个突变体数据与本文实验结果相符,验证了方法的可行性与准确性;在此基础上,结合新的质谱筛选方法,本文首次对选取的14个位点的266个可能突变体中的238个进行了系统性表征,大大拓展了环二肽酶关键位点的突变效应数据。遗憾的是,从半理性设计文库中并未发现可以合成新产物的 AlbC 突变体。
研究团队进一步利用易错 PCR 技术构建了 AlbC 随机突变文库,对4500个随机挑选的克隆开展无标记质谱分析,最终筛选得到3个突变体。与野生型相比,这3个突变体质谱谱图中出现了新的质荷比为247的离子峰,经高分辨质谱和二级质谱分析,新的产物鉴定为cFV,在表达野生型AlbC的菌株中未被检测到。并且,这3个突变体经 DNA 测序分析发现均只含有F186L单一突变(图2)。文章最后,作者利用分子动力模拟技术,对 F186L 突变效应的分子机制进行了推测。
图2:无标记质谱方法筛选得到AlbC突变体生产新的环二肽产物cFV
总的来说,该研究依托深圳合成生物大设施的机器人平台,开发了面向酶定向进化的无标记质谱筛选技术,在新催化活性发现这一工程目标方面进行了概念性验证。未来发展方向包括进一步提高筛选通量、扩大适用分子范围、对接不同类型质谱仪等。
论文链接:https://doi.org/10.1039/D2SC01637K
[来源:生物技术网]
2022.06.14
葛瑛领衔多位专家于《自然·综述·方法导论》发表自上而下蛋白质组学综述论文
2024.06.14
2024.06.12
2024.06.12
代谢组学、单细胞蛋白组学……ASMS2024上这些质谱新技术值得关注
2024.06.12
版权与免责声明:
① 凡本网注明"来源:仪器信息网"的所有作品,版权均属于仪器信息网,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用。已获本网授权的作品,应在授权范围内使用,并注明"来源:仪器信息网"。违者本网将追究相关法律责任。
② 本网凡注明"来源:xxx(非本网)"的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,且不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。如其他媒体、网站或个人从本网下载使用,必须保留本网注明的"稿件来源",并自负版权等法律责任。
③ 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起两周内与本网联系,否则视为默认仪器信息网有权转载。
谢谢您的赞赏,您的鼓励是我前进的动力~
打赏失败了~
评论成功+4积分
评论成功,积分获取达到限制
投票成功~
投票失败了~