分子荧光光谱的新方法、新视角、新探索

　　随着科研需求的发展，分子荧光光谱相关的新技术和新应用也在不断的深入拓展中,尤其是在附件的多样化、联机，以及其他功能性拓展方面表现得越来越明显。为了多方位展现分子荧光光谱领域的最新成果，仪器信息网特别策划制作《不可或缺分子荧光光谱技术及应用进展》网络专题，旨在展现分子荧光光谱仪的最新技术及应用情况。

　　作为分子荧光光谱领域的代表企业，HORIBA一直在推陈出新，推出了一系列分子荧光光谱新产品、新技术，给相关的科研用户提供了新的方法和视角。今天，我们特别邀请了HORIBA荧光产品经理周磊博士给大家分享HORIBA在分子荧光产品方面的布局和规划。

HORIBA荧光产品经理 周磊博士

　　仪器信息网：与其他分析仪器相比，不少人认为分子荧光光谱新产品的推出不是很活跃，甚至市场也略显“沉寂”，请问您如何评价该类仪器的市场活力及竞争格局?

　　周磊: 分子荧光光谱确实是比较经典成熟的方法，不过仪器的核心技术水平一直在不断提升，应用领域也在不断扩大。HORIBA的分子荧光产品就一直在推陈出新，这些产品技术不仅得到了仪器信息网各位专家和用户的好评，甚至多次获得仪器信息网“优秀新品奖”，对于整个荧光光谱仪的创新起到了积极鼓励的作用。

　　例如Aqualog(同步吸收-三维荧光光谱仪)，基于A-TEEM专利技术，在荧光内滤效应消除问题、超快三维荧光采集、复杂样品多组分分析等关键问题上具有全新突破，已在环境有机污染物、食品分析、医药等市场方面有突出的表现；另一款荧光寿命光谱仪Delta系列，具有全球同类产品中最快的寿命衰减采集时间(低至1ms)和超宽的寿命测试范围(25ps~1s)等性能。该系统一经推出，就受到了业界高度关注，发表了数篇重量级文献，其中仪器仪表类的国际一流期刊“Measurement science and technology”文章显示：“全球首次将百兆赫兹级半导体激光和超短10ns死时间TCSPC计时单元完美匹配，避免了样品的再激发和信号丢失问题，可快至1ms收集荧光衰减曲线。” 2014年刊登在“Spectrochimica acta part A: molecular and biomolecular spectroscopy”的文章显示：“基于最新技术的DeltaFlex系统，在无需更换检测器和电子器件条件下实现了皮秒至秒的宽寿命测试，首次利用内源氨基酸监测了不同温度对蛋白变性转换的动态影响。”另外，去年推出的小型荧光光谱仪Duetta也收到了良好反馈，解决了市场上小型荧光在近红外一区波长检测的短板，并且吸收和荧光功能二合一，因此在生物、医药等领域广受欢迎。

　　仪器信息网：从技术的角度出发，您认为目前分子荧光光谱有哪些新的技术值得期待?

　　周磊：随着稳瞬态荧光光谱技术的发展及多种硬件扩展附件的开发，如低温变温附件(液氮、液氦)、荧光显微镜耦合分析、各种激发源(白光激光器，OPO激光器、X射线源等)荧光光谱仪在不同科研实验室中发挥着重要作用。同时我们发现，在一些仪器功能上，市场正在逐渐接受新技术带来的新方法、新视角，还是以HORIBA几项新技术为例：

　　Duetta的近红外一区高效检测能力解决了常规设备700nm以后的检测短板，拍照式的CCD检测技术带来了全新动态荧光光谱采集功能，可以在磷光材料、长余辉样品、易光漂白样品等应用上获得全新视角。

　　Delta荧光寿命光谱仪中的荧光寿命动力学技术，带来了全新的动力学研究视角，解决了光漂白样品不能直接用于动力学研究的问题以及常规寿命技术采集速度慢而不能用于动力学的困难局面，该技术已经成功的被用于蛋白质和药物的相互作用研究(Photochemistry and Photobiology, 2013, 89: 1071–1078)。TRES时间分辨发射光谱技术让我们能够观察到样品分子在某一时刻的发射光谱，并且可以按照很短的时间内(皮秒、纳秒)依次观察光谱的变化，从而说明发光机理。解决了常规寿命测试技术，因为测试速度慢，光源能量低，重复频率低以及高级拟合软件分析的问题，进而造成该技术没有很好地被利用起来的问题。Delta荧光寿命光谱仪可以同时配备多个检测器(最多可配置四个检测器)，实现多通道检测，同时检测多个波长在物质作用变化时寿命的动态变化，提供全新的分析方向。

　　在时间分辨发射光谱中还有一个重要分支，延迟光谱(或磷光光谱)技术，其特点是通过门控技术(或单脉冲实时采集SSTD技术)对信号采集时间控制，有效分离不同时刻的发射光信号，譬如OLED材料中的荧光、磷光光谱分析，常规技术只是采用虚拟或者电子的门控进行采集，其是将荧光和磷光信号一并采集，最终按照时间输出，这样存在样品中的强荧光信号造成检测器饱和，而弱磷光信号又没有得到有效采集的问题。真正的门控技术，可以有效控制硬件设备的采集时间，避开荧光信号，特别适用于弱的磷光信号采集，这对于揭示磷光材料的真实发射光谱和发光机理是非常必要的手段。

　　此外，在寿命成像方面，常规技术中的逐点扫描技术，在获得一张寿命成像上花费很长的时间，HORIBA最新推出的FLIMera是一款大视场成像相机，可以实现视频级的荧光寿命成像。FLIMera不是单点共聚焦扫描成像，其每个像素点均包含4096的时间通道，24576个像素点可实现基于TCSPC的荧光寿命成像，完成快速荧光寿命成像，满足动态寿命成像的需求。

　　在日益受到客户关注的近红外区域，HORIBA模块化荧光光谱仪也有着其独有的优势，通过同一检测器就可完成稳态与瞬态的测试，并且相比较于采用常规的PMT而言，红外测试范围可以扩展至5500nm。

　　仪器信息网：从应用的角度出发，当前分子荧光光谱仪器的应用和研究热点分布在哪些领域?在科研过程中能给大家带来哪些“惊喜”?

　　周磊：荧光作为一个热门技术，一直以来被广泛用于生物医学研究、制药、化工、半导体材料、太阳能电池等领域。如今通过荧光信息给出物质相互作用时能量传递的证据，比如载流子寿命，还可以评价材料改性的影响，这在太阳能、光催化材料开发中有重要意义。

　　例如，在OLED发光材料中，已经不局限于过去的激发/发射光谱、量子产量的测定。随着第三代OLED的进展，TADF得到了重点关注，在TADF机理阐述中对于延迟光谱(或磷光光谱)的表征显得尤其重要，这对荧光光谱仪提出了更高的要求，不仅仅局限于常规功能上的采集，还需要延迟光谱能力，以及极短微妙寿命测试。太阳能材料中的钙钛矿作为明星材料已经得到跨越式发展，在太阳能电池研究过程中，对于载流子传输的表征尤其重要。寿命技术是一种便捷、易于使用的方法，但是太阳能钙钛矿层极其薄(nm级别)、发射波长偏红外、表面散射光强以及怕水和氧气，这些对于寿命设备的灵敏度、检测能力、光路设计、测试速度和气氛保护装置都提出了更高的要求。

　　荧光影像技术在生物医学研究和临床诊断检测中已经被广泛使用。近红外探针的开发在荧光影像技术中具有广阔的应用前景。近红外探针分为近红外一区和近红外二区探针，在常规的荧光光谱仪中很难满足这两个区的波长范围，特别是近红外一区的检测，典型的PMT检测波长范围难以达到，而科研大型模块化设备需要定制化配置和高成本、操作复杂的近红外PMT(例如型号R5509的PMT，需要预热2h，续流型消耗液氮)。

　　中红外材料在通信、环境监测及医学等领域具有重要的应用价值，因为其发光的波长范围处于中红外段，常规的荧光设备很难实现这个波长范围检测，并且过去的技术中又很难检测发光寿命。提供适用波长范围的高灵敏度检测器，并且同时能够检测寿命的检测器尤为重要。

　　仪器信息网：分子荧光光谱仪相关的应用标准情况怎么样?在应用拓展方面，有哪些制约因素?

　　周磊：分子荧光光谱仪相关的一些国家标准正在制定，HORIBA也参与到了一些标准的制定中去，例如教育部的行业标准“荧光光谱分析方法通则”等。作为HORIBA用户，美国NIST还基于HORIBA的荧光光谱仪制定了荧光标准方法。

　　我也从HORIBA用户国家计量科学院的贾志立副研究员那了解到：现在分子荧光光谱仪相关的应用标准，主要针对的是分光光度计，一方面是仪器相关的标准，包括仪器的分级、技术要求和试验方法等：另一方面是检测方法的标准，如叶绿素含量测定、炭黑分散性和刑事技术的微量物证的检测方法等，检测方法中关于发光物质荧光检测相关的标准较少。

　　另外，分子荧光光谱仪不仅包括分光光度计，还包括光学显微镜与光谱仪相结合的微区荧光系统，微区荧光系统在研究荧光材料的显微光谱信息方面应用广泛，但目前缺乏相关的标准。

　　目前在分子荧光光谱的应用拓展方面，还受到一些因素的制约：一方面可能是相关标准的宣贯方面不足：另一方面是一些仪器客户如高校、研究所的科研人员，对相关标准不熟悉，没有认识到标准在科研应用中的重要性：除此之外，相关标准物质的缺乏也会限制校准方法类标准的应用拓展。

　　仪器信息网:贵公司当前主推的产品?最具优势的领域?

　　周磊:HORIBA是唯一研发设计生产全系列科研荧光光谱仪的厂家，型号涵盖了稳瞬态光谱仪，覆盖了紫外-可见、近红外、中红外光谱范围。针对不同应用领域，HORIBA会根据客户的实际应用需求特点，来推荐相应的特色配置，可以说我们并不会强调说主推某款产品。

　　譬如：Aqualog主要针对于复杂水环境，大气颗粒物中的发光基团等的整体研究，无论是软件功能或者硬件设计，都从环境工作者的角度出发，解决环境科研分析的需求。例如通过专业软件，进行化学计量学分析；Duetta针对于生物荧光探针等具有近红外一区快速检测需求的应用时(量子点，有机荧光探针、金纳米团簇等)，由于其配备的CCD具有一次性采谱与宽检测范围(250~1100nm)的特点，在连续监测范围上十分具有优势，按压式的样品仓方面客户在实验室环境中操作时的便捷性，不开盖加样的设计满足了客户在测试过程中去添加样品，以此来查看两种或多种物质在反应过程中全谱的变化信息；荧光寿命光谱仪具有高能量窄脉宽寿命光源，皮秒稳瞬态检测器及自动拟合寿命软件，在太阳能钙钛矿，光催化研究中得到了广大科研用户的认可；模块化荧光光谱仪产品，通用性强，采用开放式模块化光路设计，根据用户的需求定制系统，并且在近红外光谱和寿命采集上具有其独有优势，可以同时检测近红外光谱与寿命。全新软件可以实现稳瞬态功能同时控制，内含特质化功能，同时包含多种数据处理方式，融合多种寿命测试技术，多元化满足客户寿命测试需求。模块化荧光光谱仪等主要针对于多功能，高灵敏度，定制化的科研领域在近红外研究领域，如稀土元素掺杂的材料中更有其独有的优势(碳管，三维荧光需求)，同一检测器就可实现近红外光谱与寿命的测量，性价比更高)；DeltaFlex和DeltaPro专注于荧光寿命的表征，在表征钙钛矿材料中载流子等方面(分子互作，比率荧光)，有着很大的应用优势；视频级的荧光寿命成像技术(FLIMera荧光寿命成像相机)，在研究神经传导，分子微环境(如pH值、离子浓度的不同)等领域有着非常广泛的潜在应用。

　　仪器信息网：针对当前的市场格局，贵公司在分子荧光光谱产品方面有什么样的定位和布局?

　　周磊：HORIBA是以客户的需求为导向，不断开发满足客户不同应用需求的产品，并且针对不同热点研究领域，提供针对性的配置方案。HORIBA着重于科研应用市场，并且深入工业分析、研发市场。如果说HORIBA以往产品技术更加专注和擅长于高端科学研究领域，将来，更多领域的应用都需要更专业的仪器，我们会向专业化方向发展，新品Duetta的更快捷测试技术、更小巧的外观设计等也使该产品从科学研究领域向分析测试、工业应用市场的拓展成为可能，分析测试、工业领域等未来潜力市场也将得到HORIBA的重点关注。